嶺南特色飲片制佛手的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張秋霞,汪金玉,陳燕霞,陳康,王紅陽,黃玉梅,朱銀姬,高明

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；3.廣州市藥材公司中藥飲片廠，廣東廣州 510360）

佛手為蕓香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥果實(shí)。味辛、苦、酸，性溫，歸肝、脾、胃、肺經(jīng)，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效，用于肝胃氣滯所致的胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等癥[1]。嶺南地區(qū)臨床應(yīng)用佛手時多蒸制后（稱“制佛手”）入藥，其目的是降低辛燥性[2]。制佛手作為嶺南特色飲片曾收錄于《廣東省中藥炮制規(guī)范》（1984版）[2]，但未被《廣東省中藥飲片炮制規(guī)范》2011版（第一冊）收載，因而無法對其質(zhì)量做出客觀科學(xué)評價(jià)與監(jiān)控。至今尚未見系統(tǒng)的相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過采用薄層色譜法及高效液相色譜（HPLC）法對嶺南特色飲片蒸制佛手進(jìn)行定性定量分析，以期為其質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器 ALLIANCE高效液相色譜儀（美國Waters公司，e2695四元泵，2998 PDA檢測器，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，Empower3色譜工作站）；BP211D電子天平（d=0.01 mg，德國Sartorius公司）；XS225A電子天平（d=0.000 1 g，瑞士Precisa公司）；TC-15恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）；KO-300D超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥 橙皮苷（中國藥品生物制品檢定所，批號：110721-200613）；5，7-二甲氧基香豆素（中國藥品生物制品檢定所，批號：120711-201213）；5-羥甲基糠醛（5-HMF，中國藥品生物制品檢定所，批號：111626-201308）；佛手對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：120933-201405）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；純凈水（華潤怡寶食品飲料有限公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。制佛手樣品部分由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制實(shí)驗(yàn)室按文獻(xiàn)[2]自制，部分購買于廣東省內(nèi)的某些藥店和中藥飲片廠，部分購買于廣州清平藥材市場，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院高明副教授鑒定為蕓香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥果實(shí)的炮制品。具體見表1。

2 薄層色譜鑒別

2.1 對照品溶液的制備 分別取適量的5，7-二甲氧基香豆素和5-羥甲基糠醛對照品，精密稱定，加甲醇溶解，分別配制成濃度為1 mg∕mL和0.1 mg∕mL的溶液，即得。

表1 制佛手樣品信息Table 1 Information for processed Fructus Citri Sarcodactylis samples

2.2 供試品溶液的制備 取樣品及對照中藥材粉末1.0 g，加乙醇10 mL，超聲20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?.5 mL使溶解，即得。

2.3 方法與結(jié)果 吸取制佛手飲片供試品溶液與對照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯（1.5∶1）展開系統(tǒng)，采用硫酸法控制展開缸內(nèi)濕度，令其在濕度為47%的條件下展開，上行展開8 cm；取出，晾干，置紫外光（365 nm）和熒光（254 nm）下檢視；取出，噴體積分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇溶液，105℃烘至斑點(diǎn)清晰；取出，日光下檢視。硅膠GF254預(yù)制版（青島海洋化工廠分廠）；溫度：室溫；濕度：47%。結(jié)果見圖1～3。

3 橙皮苷與5，7-二甲氧基香豆素、5-羥甲基糠醛含量測定

3.1 對照品溶液的制備

3.1.1 橙皮苷對照品溶液 取橙皮苷對照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成每1 mL含橙皮苷40 μg的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

圖1 制佛手飲片薄層色譜圖（365 nm）Figure 1 Thin-layer chromatogram of processed Fructus Citri Sarcodactylis（365 nm）

圖2 制佛手飲片薄層色譜圖（254 nm）Figure 2 Thin-layer chromatogram of processed Fructus Citri Sarcodactylis（254 nm）

圖3 制佛手飲片薄層色譜圖（日光下）Figure 3 Thin-layer chromatogram of processed Fructus Citri Sarcodactylis（in daylight）

3.1.2 5，7-二甲氧基香豆素對照品溶液 取5，7-二甲氧基香豆素對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成每1 mL含5，7-二甲氧基香豆素101 μg的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

3.1.3 5-羥甲基糠醛對照品溶液 取5-羥甲基糠醛對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成濃度為1 mg∕mL的母液，再取1 mL母液；置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，稀釋配置成每1 mL含5-羥甲基糠醛1 mg的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

3.2 供試品溶液的制備

3.2.1 橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素供試品溶液 按照《中華人民共和國藥典》（《中國藥典》）2015版[1]，取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷；再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。供測定橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素用。

3.2.2 5-羥甲基糠醛供試品溶液 取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL；稱定質(zhì)量，超聲40 min，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量；搖勻，濾過，取續(xù)濾液；過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。供測定5-羥甲基糠醛用。

3.3 色譜條件

3.3.1 橙皮苷 按照《中國藥典》2015版[1]。色譜柱：Thermo C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇—水—冰醋酸（33∶63∶2）；流速：1.0 mL∕min；檢測波長：284 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。橙皮苷保留時間為12.116 min。色譜圖見圖4。

3.3.2 5，7-二甲氧基香豆素 參照文獻(xiàn)[3]。色譜柱：Thermo C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇—水（65∶35）；流速：1.0 mL∕min；檢測波長：326 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。5，7-二甲氧基香豆素保留時間為5.016 min；色譜圖見圖5。

3.3.3 5-羥甲基糠醛 參照文獻(xiàn)[4]。色譜柱：Thermo C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇—0.01 mol∕L磷酸水（10∶90）；流速：1.0 mL∕min；檢測波長：285 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。5-羥甲基糠醛保留時間為6.816 min。色譜圖見圖6。

3.4 線性關(guān)系考察

圖4 橙皮苷對照品和樣品色譜圖Figure 4 Chromatogram for hesperidin reference and sample

圖5 5，7-二甲氧基香豆素對照品和樣品色譜圖Figure 5 Chromatogram for 5，7-dimethoxycoumarin reference and sample

圖6 5-羥甲基糠醛對照品和樣品色譜圖Figure 6 Chromatogram for 5-hydroxymethylfurfural reference and sample

3.4.1 橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素 取橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素對照品溶液，進(jìn)樣體積分別 為 2、 4、 6、 8、 10、 12 μL， 按 照 “3.3.1”“3.3.2”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，以峰面積（Y）對橙皮苷的含量（X，μg）進(jìn)行線性回歸。橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素的回歸方程見表2。結(jié)果表明橙皮苷含量在0.08～0.48 μg和5，7-二甲氧基香豆素含量在0.20～1.212 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4.2 5-羥甲基糠醛 取5-羥甲基糠醛對照品溶液，進(jìn)樣體積分別為0.5、1、2、5、10、20、30 μL，按照“3.3.3”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，以峰面積（Y）對5-羥甲基糠醛量（X，μg）進(jìn)行線性回歸。5-羥甲基糠醛的回歸方程見表2。結(jié)果表明5-羥甲基糠醛含量在0.005～0.300 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羥甲基糠醛的回歸方程Table 2 The regression equation of hesperidin，5，7-dimethoxycoumarin and 5-hydroxymethylfurfural

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（n=6），按“3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)6次，記錄峰面積，計(jì)算橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素、5-羥甲基糠醛的含量。計(jì)算供試品溶液中橙皮苷的平均含量為0.858 mg∕g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（sR）為0.41%；5，7-二甲氧基香豆素的平均含量為2.138 mg∕g，sR為 0.69%；5-羥甲基糠醛含量的平均值為0.142 1 mg∕g，sR為0.77%。表明儀器精密度良好。

3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（n=6），按“3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)6次，記錄峰面積，計(jì)算橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素、5-羥甲基糠醛的含量。供試品溶液中橙皮苷的平均含量為 0.842 mg∕g，sR為 1.16%；5，7-二甲氧基香豆素的平均含量為 2.194 mg∕g，sR為3.82%；5-羥甲基糠醛的平均含量為0.142 4 mg∕g，sR為1.67%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品溶液（n=6），按“3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)6次，記錄峰面積，計(jì)算橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素、5-羥甲基糠醛的含量。供試品溶液中橙皮苷的平均含量為 0.841 mg∕g，sR為0.98%；5，7-二甲氧基香豆素的含量的平均含量為 2.152 mg∕g，sR為0.59%；5-羥甲基糠醛的平均含量為0.141 9 mg∕g，sR為0.68%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品6約0.5 g，共6份，分別精密加入橙皮苷對照溶液（濃度為0.402 mg∕mL）和 5，7-二甲氧基香豆素對照溶液（濃度為0.750 mg∕mL）、5-羥甲基糠醛對照溶液（濃度為 0.060 mg∕mL）各1 mL；按照“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算橙皮苷、5，7-二甲氧基香素、5-羥甲基糠醛的含量。橙皮苷的平均加樣回收率為98.26%，sR為1.26%；5，7-二甲氧基香豆素平均加樣回收率為96.28%，sR為1.90%；5-羥甲基糠醛的平均加樣回收率為98.12%，sR為0.63%。

3.6 樣品含量測定 供試品溶液按“3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，每批樣品平行測定3次，計(jì)算橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羥甲基糠醛（5-HMF）的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羥甲基糠醛（5-HMF）的含量Table 3 Comparison of the contents of hesperidin，5，7-dimethoxycoumarin and 5-hydroxymethylfurfural in the samples （n=3；）

表3 樣品中橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羥甲基糠醛（5-HMF）的含量Table 3 Comparison of the contents of hesperidin，5，7-dimethoxycoumarin and 5-hydroxymethylfurfural in the samples （n=3；）

編號1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14橙皮苷[w∕（mg·g-1）]0.595±0.03 0.142±0.02 0.233±0.03 0.221±0.00 0.711±0.01 0.210±0.01 0.583±0.00 0.204±0.03 0.273±0.01 0.788±0.02 0.159±0.00 0.332±0.01 0.233±0.01 0.405±0.01 sR∕%0.60 1.01 1.32 1.31 0.66 1.79 0.44 1.28 1.21 0.34 1.92 2.80 0.83 0.40 5，7-二甲氧基香豆素[w∕（mg·g-1）]1.168±0.01 1.628±0.01 1.181±0.02 0.671±0.01 0.642±0.01 0.801±0.02 1.394±0.01 0.731±0.04 1.411±0.01 1.747±0.09 0.711±0.00 0.916±0.01 0.770±0.00 0.766±0.02 sR∕%0.06 0.52 1.15 0.84 1.69 1.04 0.62 0.86 0.41 0.03 0.46 1.14 0.19 0.90 5-HMF[w∕（mg·g-1）]0.538±0.02 0.142±0.02 0.901±0.03 0.303±0.00 0.400±0.01 0.141±0.01 0.104±0.00 0.091±0.03 0.242±0.01 0.078±0.02 0.169±0.05 0.123±0.00 0.028±0.01 0.067±0.01 sR∕%0.49 1.01 3.72 0.37 2.51 1.18 2.13 1.73 1.29 1.28 0.67 0.71 1.29 1.49

4 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了薄層層析不同展開系統(tǒng)及不同檢視方法，最終確定以效果較佳的環(huán)己烷∶乙酸乙酯（1.5∶1）為展開系統(tǒng)。由于5-羥甲基糠醛在365 nm紫外檢視不顯熒光，圖譜未能顯示其斑點(diǎn)特征。而采用254 nm紫外檢視及體積分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇為顯色劑，105℃烘至顯色日光檢視，能較好地檢視圖譜各斑點(diǎn)的特征，故選用以上參數(shù)為該薄層色譜的檢視條件。本實(shí)驗(yàn)所得的薄層圖譜斑點(diǎn)清晰，信息量較豐富，可作為制佛手的薄層色譜鑒別方法。

由薄層圖譜可見，用254 nm紫外和體積分?jǐn)?shù)10%硫酸乙醇顯色后檢視，制佛手在與5-羥甲基糠醛對照品相同的位置上顯示出主斑點(diǎn)的特征，而生品佛手未顯示該斑點(diǎn)特征，該特征可以用于生制品的鑒別。有關(guān)炮制對其化學(xué)成分和藥效的影響目前正在研究中。鑒于此，本研究除按照《中國藥典》2015版佛手中橙皮苷含量測定外，還增加測定5，7-二甲氧基香豆素和5-羥甲基糠醛的含量，可為制定和完善嶺南特色飲片制佛手的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

本研究中14批制佛手樣品中橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素和5-羥甲基糠醛的含量存在較大差異，橙皮苷含量在0.142～0.788 mg·g-1之間，均值為0.364 mg∕g。按國家藥典委員會的要求初步擬定，按干燥品計(jì)算，含橙皮苷（C28H34O15）不得少于0.10%。5，7-二甲氧基香豆素含量在0.642～1.747 mg∕g之間，均值為 1.038 mg∕g。按國家藥典委員會的要求初步擬定，按干燥品計(jì)算，含5，7-二甲氧基香豆素（C11H10O4）不得少于0.50%。5-羥甲基糠醛的含量在0.028～0.901 mg∕g之間，均值為0.238 mg∕g。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：收集的14批樣品中3種指標(biāo)成分含量相差較大，這可能與樣品來源的不同、炮制工藝的可控程度不高及儲存方法等因素有關(guān)。

關(guān)于5-羥甲基糠醛的安全性研究比較多，但意見并不統(tǒng)一。有學(xué)者認(rèn)為5-羥甲基糠醛是有害的，有致突變、生殖毒性及致癌變的作用[5-7]；另一方面，有學(xué)者研究顯示5-羥甲基糠醛有抗心肌缺血、抗氧化、抗鐮狀細(xì)胞貧血等生物活性[8，9]。制佛手炮制過程中生成的5-羥甲基糠醛，其作用是有益或是有害仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。