基于便秘模型小鼠相關差異蛋白表達探討中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論

季幸姝,李燕舞,周福生,侯麗穎

（1.廣州中醫(yī)藥大學脾胃研究所，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學期刊中心，廣東廣州 510006）

中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論，最早源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，是中醫(yī)臟腑表里學說的重要組成部分，對指導臨床有著不可忽視的重要作用。結合現(xiàn)代醫(yī)學的知識，大都認為中醫(yī)的“肺和大腸”，基本上與現(xiàn)代醫(yī)學的肺與腸道相吻合。目前對“肺與大腸相表里”的實驗研究，從肺與大腸生理、病理上的聯(lián)系，可以找到一些散在的、間接的證據(jù)。胚胎發(fā)育期肺與大腸密切的生理關系顯示，肺、氣管由腸的前腸發(fā)展而來，呼吸道上皮和腺體由原腸內(nèi)胚層分化而成。肺、氣管與腸的結構來源是相同的，這可能成為“肺與大腸相表里”這一理論的結構基礎，使該理論從蛋白質(zhì)角度出發(fā)研究其實質(zhì)成為可能。因此，本研究試圖從現(xiàn)代醫(yī)學蛋白質(zhì)組學的角度，從中醫(yī)腸病及肺的角度，尋找肺腸相關指標，即通過觀察“便秘”模型小鼠的結腸組織差異表達蛋白，研究與分析“腸病及肺”，從而揭示“腸病及肺”的病理機制，以便更好地理解和完善中醫(yī)臟腑表里理論，為臨床治療和中醫(yī)理論客觀化提供依據(jù)?，F(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 NIH小鼠20只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，顆粒飼料喂養(yǎng)，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。許可證號：SCXK（粵）2008-0002，粵監(jiān)證字2008A021。

1.2 藥品 復方地芬諾酯片，常州康普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：0903037。

1.3 儀器與試劑 LEICA-UCT型超薄切片機（德國Leica公司）；JEM-1200EX型透射電鏡（日本電子株式會社）。體積分數(shù)2.5%戊二醛固定液、0.1 moL∕L磷酸鹽緩沖液、體積分數(shù)1%鋨酸固定液、乙醇、Spurr樹脂、醋酸鈾、枸櫞酸（上海生化）。

1.4 復制便秘小鼠模型 實驗隨機分成2組：正常組、便秘組。按10mg·kg-1含藥標準，將復方地芬諾酯片加入9 g∕L生理鹽水，每只小鼠灌胃20 mL·kg-1，每日1次。連續(xù)4 d。造模結束后觀察兩組小鼠排便情況。便秘小鼠首次排黑便時間、6 h內(nèi)的排黑便粒數(shù)及黑便濕質(zhì)量均較正常小鼠明顯減少，表明便秘模型復制成功。

1.5 肺組織蛋白提取 實驗所用肺組織，分別取自正常對照組和便秘模型組小鼠。肺組織樣品冰凍狀態(tài)放入研磨器中，以堅硬物敲擊研磨棒壓碎組織，在液氮中研磨樣品成粉末狀。用刮勺把組織粉末收集于勻漿器內(nèi)，300 mg組織約需要1 mL裂解液，冰浴中勻漿。1 000 r∕min離心10 min；收集勻漿液于EP管中，液氮反復凍融3次，每次融開后注意混勻。離心管加入核酸酶（DNA酶、RNA酶），按照每500 mg組織中加入質(zhì)量濃度10 mg∕mL的核酸酶 12 μL、4 μL（或 50 μg∕mL RNase及 200 μg∕mL DNase，）的比例加入，放入冰浴裂解20 min。 15 000 r∕min，4 ℃離心60 min（或40 000 r∕min，4℃離心30 min），收集上清。2-D蛋白定量試劑盒測定每組小鼠肺組織蛋白質(zhì)后，分別取每個樣本的300 μg進行組內(nèi)樣本混合，然后再對混合好的模型組和正常對照組樣本分別定量。每次上樣前均予再次定量，以保證上樣量的精確性。

1.6 雙向凝膠電泳（2-DE） 將蛋白樣品進行第一向電泳。等電聚焦電泳（IEF）參數(shù)設置為：30 V、12 h（膠條再水化）；500 V、1 h；1 000 V、1 h；8 000 V、30 min；10 000 V、10 h；500 V、12 h；85 000 Vh收膠。IEF結束后，在平衡緩沖液中平衡膠條。將膠條轉移至12.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）膠面上行第二向電泳，參數(shù)設置為：2 W∕gel、12 W，50 min后改為17 W∕gel、100 W；直至膠內(nèi)電泳指示劑溴酚藍跑出凝膠下緣10 min。然后進行銀染。

1.7 圖像采集與分析 使用ImageScanner專業(yè)圖像掃描儀對凝膠成像，用PDquest凝膠圖像分析軟件進行圖譜分析。凝膠圖像經(jīng)識別、分析后，尋找差異點。選取蛋白斑點豐度差異大于2.5倍的蛋白質(zhì)斑點，且同組2塊凝膠圖譜均出現(xiàn)相同變化，視其為差異蛋白點。

1.8 質(zhì)譜圖的獲取 用Spot Handling Workstation對染色的凝膠處理，取AnchorChip靶點樣后在質(zhì)譜上進行基質(zhì)輔助激光解吸電離—串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF∕TOF）分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）和利用LIFT軟件將對4個強度最大峰肽段進行串級質(zhì)譜分析。

1.9 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析 使用Biotools軟件檢索，以MASCOT為搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進行搜索，參數(shù)設置為：檢索種屬為Rattus；數(shù)據(jù)檢索的方式為combined；最大允許漏切位點為1；酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設置：PMF 50 ppm，MS∕MS 0.5 Da。

2 結果

2.1 2組小鼠肺組織蛋白質(zhì)差異表達 正常對照組和便秘模型組銀染小鼠肺組織蛋白質(zhì)2-DE圖像如圖1、2。選取3個明顯差異蛋白質(zhì)點（蛋白表達量均相差2.5倍以上），其中BD1、BD3為下調(diào)蛋白，BU3為上調(diào)蛋白。差異蛋白點放大，如圖3。

圖1 正常小鼠肺組織蛋白2-DE分離圖像及差異蛋白分布Figure 1 Two-dimensional electrophoresis（2-DE）separation image of total proteins in lung tissues of normal mice and distribution of the differential proteins

圖2 便秘小鼠肺組織蛋白2-DE分離圖像及差異蛋白分布Figure 2 2-DE separation image of total proteins in lung tissues of cough mice and distribution of the differential proteins

圖3 BD1、BD3、BU3差異蛋白點放大圖Figure 3 The amplified plot in various differential protein spots

2.2 搜索數(shù)據(jù)庫鑒定差異蛋白質(zhì) 將2組小鼠肺組織差異蛋白質(zhì)的PMF，通過Mascot搜索軟件匹配到swissprot數(shù)據(jù)庫中，BD1、BD3、BU3分別鑒定為細胞色素c氧化酶亞基5A（COX5A）、過氧化物氧化還原酶2（Prdx-2）和肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2（MLC-2）。各蛋白鑒定信息詳見表1。

3 討論

本研究通過數(shù)據(jù)庫檢索分析結果發(fā)現(xiàn)，便秘小鼠肺組織3個差異表達蛋白質(zhì)COX5A、Prdx-2、MLC-2都能在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫獲得匹配信息，前二者為氧化—抗氧化系統(tǒng)蛋白，后者為細胞骨架蛋白。便秘小鼠肺組織COX5A、Prdx-2表達量均降低，而MLC-2表達量升高。從中可以看出，氧化—抗氧化系統(tǒng)失衡可能是腸病及肺的發(fā)病機制之一。

有研究認為，腸道不僅是人體內(nèi)最大的貯菌所和內(nèi)毒素庫，而且是觸發(fā)全身炎性介質(zhì)釋放的啟動器，腸道內(nèi)細菌或內(nèi)毒素的移位，和胃腸道相關淋巴組織及其他腸黏膜細胞產(chǎn)生促炎反應釋放大量促炎介質(zhì)關系密切，它們共同的病理生理學基礎，是腸道的缺血再灌注損傷；腸道缺血再灌注損傷后的直接結果，是損害腸黏膜屏障和激發(fā)腸道促炎反應[1]。

各種致病因素在肺內(nèi)造成的損傷都可激活巨噬細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞，引起各種介質(zhì)釋放，如細胞因子、趨化因子、血小板活化因子（PAF）等，同時這些介質(zhì)也會造成中性粒細胞的活化并釋放出活性氧簇（ROS），導致肺內(nèi)“炎癥”過程發(fā)生。這一過程固然對殺死各種病原體十分重要，但亦會引起肺內(nèi)的氧化應激[2]，使細胞發(fā)生凋亡或壞死并破壞微血管的屏障功能。

其中肺組織線粒體在氧化應激中起著舉足輕重的作用。由于線粒體呼吸鏈是真核細胞代謝能量三磷酸腺苷（ATP）的主要來源，是有氧呼吸的關鍵途徑，大量消耗的氧直接與線粒體呼吸鏈的電子傳遞體系相聯(lián)系，因此在有氧代謝過程中大量的ROS會持續(xù)不斷地產(chǎn)生。而線粒體是細胞內(nèi)ROS的主要發(fā)生器，故極易遭ROS攻擊而損傷，尤其是在低氧情況下需加強線粒體呼吸鏈功能時[3，4]。細胞色素c氧化酶（cytochrome oxidase，COX）就是線粒體的標志酶，是線粒體呼吸鏈氧化磷酸化過程中的關鍵酶。它直接以氧分子為電子受體進行電子傳遞，是線粒體完成生物氧化的最后步驟[5，6]。因此，細胞色素氧化酶活性強度的變化直接反映了線粒體有氧代謝的功能狀態(tài)，其損傷可直接影響線粒體功能，導致ATP合成減少，膜電位喪失，促使呼吸鏈大量產(chǎn)生ROS，活化凋亡信號通路，細胞出現(xiàn)死亡（凋亡或壞死）。我們研究結果發(fā)現(xiàn)的差異蛋白COX5A是COX含亞鐵血紅素A鏈。

表1 數(shù)據(jù)庫差異蛋白質(zhì)鑒定信息Table 1 Information of various differential proteins identified in database

肺內(nèi)亦存在豐富的抗氧化防御系統(tǒng)，如本研究發(fā)現(xiàn)的與Prdx-6同屬于非硒依賴過氧化物酶家族的差異蛋白Prdx-2就屬于其中，肺內(nèi)這種抗氧化機制可確保生理狀況下氧化—抗氧化系統(tǒng)的平衡，而一旦體內(nèi)的抗氧化代償機制被破壞或不足，造成機體氧化—抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，氧化損傷即開始啟動，造成肺損傷[7]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，COX5A和Prdx-2在便秘小鼠肺組織中表達水平均較正常組下調(diào)，這說明便秘小鼠肺細胞線粒體有氧代謝功能下降，可能是由于過多的ROS在體內(nèi)不能及時清除，造成肺細胞發(fā)生氧化應激損傷的結果。

除此之外，本研究結果還發(fā)現(xiàn)，MLC-2在便秘組小鼠肺組織細胞中表達水平較正常小鼠上調(diào)。MLC-2是肌球蛋白的重要組成部分，它在調(diào)節(jié)肌球蛋白的活性中發(fā)揮作用，肌球蛋白輕鏈必須纏繞在重鏈上才能保持其天然的活性構象[8]。MLC-2是細胞骨架的分子馬達，MLC-2通過Ser19、Thr18磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)肌球蛋白活性，在有肌動蛋白存在的情況下，控制肌球蛋白頭部構象，可大大提高肌球蛋白的ATP酶活性，廣泛參與細胞質(zhì)流動、細胞器運動、細胞遷移、細胞內(nèi)吞、物質(zhì)運輸、有絲分裂、胞外分泌和信號轉導等生物學過程[9]。便秘小鼠肺組織細胞MLC-2表達上調(diào)可能是肺細胞為抗氧化應激損傷而產(chǎn)生的防御作用。

從上述研究結果可以看出，便秘小鼠“腸病及肺”時，可能由于大腸傳導功能失調(diào)不能正常將糟粕排除體外，上逆影響至肺，致肺組織細胞不能正常發(fā)揮抗氧化損傷的作用，使ROS在體內(nèi)大量堆積，造成肺細胞發(fā)生氧化應激損傷。

值得一提的是，臨床觀察常見在創(chuàng)傷、大手術、休克、燒傷等情況下肺往往是第一個受累的器官，這可能是由于腸系膜淋巴管引流的腸淋巴液經(jīng)胸導管進入右心，肺因而成為暴露于腸源性炎癥介質(zhì)的第一個器官。這種解剖結構可以解釋臨床上的這一現(xiàn)象[10]，也為本課題進行“腸病及肺”病機研究提供了重要的解剖學原因。

綜上所述，“肺與大腸相表里”中的肺與腸在正常情況下可能是處于氧化—抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡關系。而在各種原因造成的大腸病理狀態(tài)時，氧化—抗氧化系統(tǒng)平衡被破壞，肺與腸的關系出現(xiàn)紊亂。一旦發(fā)生病變，肺腸之病可以相互傳變、累及，惡性循環(huán)。

其中，作為在“肺病及腸”[11]、“腸病及肺”中均表現(xiàn)差異的過氧化物氧化還原酶（peroxiredoxin）家族蛋白可能起了重要作用，值得進一步探討。