低溫脅迫后五味子‘嫣紅’葉片形態(tài)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

許培磊，韓先焱，范書田，王月，張寶香，李昌禹，艾軍，路文鵬※，吳漢

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；3.荏平縣信發(fā)街道林業(yè)站，山東 聊城 252000）

五味子〔Schisandra chinensis (Turcz.) Baill〕主要分布于中國(guó)東北、朝鮮半島、日本、韓國(guó)及俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)，其果實(shí)為我國(guó)的常用名貴中藥材。近年來，五味子人工栽培迅猛發(fā)展，由于五味子原生境多為半陰生環(huán)境，空氣濕潤(rùn)、溫度變化緩和，而在人工栽培條件下葉片常常受到霜害等不利環(huán)境條件的影響，影響植株的生長(zhǎng)和正常開花結(jié)果[1]，影響產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。早春霜害一般發(fā)生在每年的5 月5～20 日，常出現(xiàn)1～2 次3～ 2 ℃低溫。東北地區(qū)五味子種植區(qū)每年都會(huì)發(fā)生不同程度的霜凍危害，程度比較輕的部分枝葉凍傷和花器官受害，嚴(yán)重的則直接導(dǎo)致死亡[2]。五味子栽培面臨減產(chǎn)和顆粒無收的風(fēng)險(xiǎn)。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可以快速、靈敏地檢測(cè)植物光合生理狀況，直觀地顯示低溫對(duì)植物的脅迫及植株的抗性[3]。因此，本研究對(duì)低溫脅迫下五味子葉片的熒光特性進(jìn)行檢測(cè)，旨在為篩選五味子抗低溫種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所五味子資源圃中‘嫣紅’品種為試材，選擇生長(zhǎng)勢(shì)、株高大致相同的2 年生盆栽嫁接植株18 盆，于2016 年8 月上旬，每株選取葉片大小、生長(zhǎng)狀況一致的向陽(yáng)健康成熟葉片為試材供測(cè)定。

1.2 方法

將五味子品種‘嫣紅’盆栽苗放在1 ℃和6 ℃的環(huán)境中處理1、2、3 d，每個(gè)處理選3 盆植株，在不同處理時(shí)間運(yùn)用葉綠素?zé)晒獬上駜x對(duì)葉片的熒光參數(shù)進(jìn)行測(cè)定、成像分析和石蠟切片觀察。

1.2.1 石蠟切片方法 植物組織結(jié)構(gòu)的觀察采用石蠟切片法，將經(jīng)FAA 固定的試驗(yàn)材料，通過叔丁醇梯度脫水、滲蠟、浸蠟、包埋等過程，用自動(dòng)切片機(jī)切片，切片厚度10～12m，番紅-固綠對(duì)染，加拿大樹膠封片，顯微鏡觀察并照相，圖片放大倍數(shù)為100 。

1.2.2 葉綠素?zé)晒獬上裼^察 采用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，葉片經(jīng)暗適應(yīng)20 min，將待測(cè)葉片置于樣品臺(tái)，每個(gè)葉片上設(shè)定3 個(gè)直徑1 cm的自動(dòng)光學(xué)檢測(cè)（AOI），調(diào)節(jié)測(cè)量光0.5mol（/m2·s），測(cè)定初始熒光Fo，設(shè)置光化光強(qiáng)度PAR 為205mol（/m2·s）（植物用來進(jìn)行光合作用，與生長(zhǎng)環(huán)境光強(qiáng)一致），飽和脈沖強(qiáng)度為2 700mol（/m2·s），持續(xù)時(shí)間為0.8 s。在軟件的Kinetics窗口檢測(cè)各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的動(dòng)力學(xué)變化曲線，相應(yīng)數(shù)據(jù)可直接從Report 窗口導(dǎo)出。相關(guān)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)包括光合系統(tǒng)Ⅱ（以下簡(jiǎn)稱 PSⅡ）的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm（PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化率）、PSⅡ的實(shí)際量子產(chǎn)量PSⅡ、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NPQ）、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NO）、電子傳遞速率rETR。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

五味子葉片葉肉組織由上表皮（a）、柵欄組織（b）、海綿組織（c）和下表皮（d）組成。對(duì)照五味子葉片的葉肉組織顯示，柵欄組織排列緊密，細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)等內(nèi)含物較多；與對(duì)照相比，低溫脅迫使葉片厚度變薄，1 ℃和6 ℃脅迫分別處理1 d和2 d時(shí)，其柵欄組織變得松散稀疏，內(nèi)含物變少，染色較淺，以處理1 d 時(shí)更為明顯；但隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，第3 天時(shí)，其柵欄組織逐漸恢復(fù)緊密狀態(tài)，內(nèi)含物較處理前2 天增多；不同溫度處理間的葉肉組織結(jié)構(gòu)變化不明顯。結(jié)果見圖1。

圖1 ‘嫣紅’經(jīng)低溫脅迫后的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig.1 Mesophyll structure of'yanhong'under low temperature stress

2.2 五味子葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)及成像變化

Fv/Fm 是PS II 的最大量子效率，反映植物潛在最大光合能力[4]。1 ℃和6 ℃處理 3 d 過程中，在第 2 天1 ℃處理?xiàng)l件下，其Fv/Fm 最低，與對(duì)照相比下降了3.8%，由此可見，該參數(shù)在低溫脅迫過程中變化不大，成像結(jié)果差異亦不明顯。結(jié)果見圖2、3。

圖2 ‘嫣紅’經(jīng)低溫脅迫后的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化Fig.2 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of'yanhong'under low temperature stress

圖3 ‘嫣紅’經(jīng)低溫脅迫后的葉綠素?zé)晒獬上褡兓疐ig.3 Changes of chlorophyll fluorescence imaging of'yanhong'under low temperature stress

Y（NPQ）是PSII處調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量，在植物接受的光強(qiáng)過剩時(shí)，可以通過調(diào)節(jié)熱耗散來保護(hù)機(jī)體，是光保護(hù)的重要指標(biāo)。qN 反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也反映了植物的光保護(hù)能力[6]，該研究中，上述2 個(gè)參數(shù)變化趨勢(shì)一致，1℃處理2d的值最高，6℃處理1d的值最低，說明1℃下的光保護(hù)能力比6℃時(shí)高，其將過剩光能轉(zhuǎn)換為熱的能力較高，相比1 ℃處理?xiàng)l件，其對(duì)光的需求更低（圖2）。Y（NO）指PS II 處非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量。若Y（NO）較高，則表明光化學(xué)能量轉(zhuǎn)換和保護(hù)性的調(diào)節(jié)機(jī)制不足以將植物吸收的光能完全消耗掉。即入射光強(qiáng)超過了植物能接受的程度。這時(shí)，植物可能已經(jīng)受到損傷，或者繼續(xù)照光植物將受到損傷。Y（NO）是光損傷的重要指標(biāo)。6℃處理1 d 的Y（NO）最高，說明該條件下的入射光強(qiáng)過剩，在6℃低溫處理初始階段，葉片對(duì)光比較敏感（圖2）。

rETR為相對(duì)電子速率，常被用于反映植物受脅迫程度的指示參數(shù)[7]。低溫脅迫影響葉片的光合電子傳遞速率，隨著光強(qiáng)不斷增大，處理的電子傳遞速率均低于對(duì)照，2 d 1 ℃條件的電子傳遞速率最低，與PSⅡ趨勢(shì)一致，說明在該條件下，其光合機(jī)構(gòu)受脅迫最嚴(yán)重。結(jié)果見圖4。

圖4 ‘嫣紅’經(jīng)低溫脅迫后的光響應(yīng)電子傳遞速率變化Fig.4 Changes of electron transfer rate of'yanhong'under low temperature stress

3 結(jié)論與討論

葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)在植物應(yīng)答逆境脅迫過程中被廣泛用于抗性種質(zhì)的評(píng)價(jià)和抗性機(jī)理研究，如在番茄[8-9]、高粱[10]、篤斯越橘[11]等植物均有大量報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，低溫弱光脅迫使甜椒幼苗萎蔫并嚴(yán)重失水[12]。柵欄組織層數(shù)少、柵欄組織細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)的茶藨屬植物比較抗寒[13]。伍寶朵等[14]發(fā)現(xiàn)了胡椒葉片厚度隨低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而降低，柵欄組織和海綿組織細(xì)胞隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)損傷加劇。較抗寒的黃瓜葉片具有較強(qiáng)的保水力[15]?？梢?，低溫脅迫對(duì)植株葉片結(jié)構(gòu)影響較大。在低溫處理過程中，五味子葉片厚度變小，在處理1d和2d時(shí)，柵欄組織排列整齊度降低，細(xì)胞內(nèi)含物變少；處理3 d 時(shí)，葉片柵欄組織恢復(fù)緊密狀態(tài)，說明在零上低溫脅迫處理時(shí)，五味子葉片經(jīng)低溫脅迫后能逐漸恢復(fù)并適應(yīng)。

Fv/FM與PSⅡ的顯著降低說明，低溫導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生部分失活或傷害。本研究中，五味子經(jīng)低溫處理后，其Fv/FM參數(shù)變化與成像變化均不顯著，不能指示五味子經(jīng)低溫脅迫后的傷害PSⅡ可指示低溫處理植物的實(shí)際光合能力和實(shí)際光合效率，該值降低后又回升，表明五味子在經(jīng)歷低溫初期有抵御能力，能夠在一段時(shí)間內(nèi)維持光合效率，超過抵御的臨界點(diǎn)，其光合效率就會(huì)大幅度降低，隨后再升高，植物會(huì)有一定的自愈能力，且與脅迫程度有關(guān)，因此，該指標(biāo)可作為篩選五味子抗低溫種質(zhì)的參數(shù)。結(jié)合熒光參數(shù)成像結(jié)果PSⅡ、NPQ及Y（NPQ）均能指示出五味子在2 d 1 ℃條件下的變化PSⅡ圖像與脅迫程度相關(guān)性更大，可以直觀地體現(xiàn)五味子受脅迫程度。