雷公藤炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

許春枝

(福建省三明市國(guó)有林場(chǎng)工作站， 福建 三明365000)

雷公藤(Tripterygium wilfordii)屬衛(wèi)矛科(Celastraceae)雷公藤屬(Tripterygium)多年生落葉藤本灌木，具抗炎、活血消腫、通絡(luò)止痛、抗腫瘤等多種藥用功效(陳全助，2013)，用于治療癌癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腎小球腎炎等多種疾病(王君明等，2018；吳閩楓等，2018)，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，也是光譜植物源殺菌劑(黃明來(lái)等，2012)。 鑒于雷公藤的潛在市場(chǎng)價(jià)值，近年來(lái)由于過(guò)度采挖，雷公藤野生資源急劇下降而幾近衰竭，當(dāng)前雷公藤的開(kāi)發(fā)利用開(kāi)始由野生資源開(kāi)發(fā)向人工種植轉(zhuǎn)變，種植面積不斷擴(kuò)大，僅福建省泰寧縣便有雷公藤種苗繁育基地6.7 hm2，藥材基地1 800 hm2(陳全助，2013)。 然而隨著種植面積不斷擴(kuò)大，雷公藤病害頻繁暴發(fā)，種類(lèi)增多，為害日趨嚴(yán)重，給雷公藤產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失(陳全助，2013；謝婉鳳等，2014；張金霞等，2018)。 雷公藤炭疽病是膠孢炭疽菌(Colletotrichun gloeosporioides)引起的真菌侵染性病害(陳全助，2013)，是雷公藤推廣種植過(guò)程中危害最為嚴(yán)重的病害之一，感病植株葉片受害率100%，可造成大幅度減產(chǎn)。 目前，有關(guān)雷公藤炭疽病的研究?jī)H限于病害病原鑒定及其流行規(guī)律觀測(cè)，為尋求有效的病害控制措施，本研究選擇了4 種市場(chǎng)上常見(jiàn)的廣譜低毒殺菌劑對(duì)雷公藤炭疽病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，以期為該病害防治篩選有效防治藥劑。

1 材料與方法

1.1 炭疽病菌株和分生孢子懸浮液制備

田間自然發(fā)病新鮮病葉從福建省西北部泰寧縣(東經(jīng)116°54′～117°24′，北緯26°34′～27°07′)雷公藤種植基地處采集分離，分離方法參照方中達(dá)(1998)的組織分離法，對(duì)得到的菌種進(jìn)行純化、保存。 供試菌株在PDA 培養(yǎng)基平板培養(yǎng)5 d 后劃破菌落刺激菌落產(chǎn)孢，用無(wú)菌水將分生孢子洗脫，配制成濃度為2.5×106個(gè)·mL-1孢子懸浮液備用。

1.2 試驗(yàn)藥劑

選擇4 種市售常見(jiàn)廣譜劑型殺菌劑:40%多菌靈(Carbendazim)可濕性粉劑(河北冠龍農(nóng)化有限公司)；40%腈菌唑(Systhane)；30%苯甲·丙環(huán)唑(Benzylidene propionazole)乳油；30%嘧菌酯(Azoxystrobin)(蘇州先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)。

1.3 毒力測(cè)定方法

1.3.1 殺菌劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法測(cè)定(潘龍其等，2016；王麗等，2016；文克儉等，2001)。 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將各藥劑配制成0.333、0.250、0.200、0.167、0.143 mg·L-1濃度梯度(潘龍其等，2016；王麗等，2016；陳年春，1991)。 將上述配制的藥劑加入已滅菌熱溶解并冷卻的PDA 培養(yǎng)基中搖勻，制成系列濃度梯度含藥PDA 培養(yǎng)基平板，以無(wú)菌水代替藥劑的培養(yǎng)基作對(duì)照。 取直徑0.5 cm 菌株菌餅，接種各處理PDA 培養(yǎng)基，每個(gè)處理重復(fù)3 次，置25 ℃人工氣候箱恒溫培養(yǎng)4 d，“十字交叉法”測(cè)定菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑制率(陳年春，1991；游文莉等，2003；于靜亞等，2017；范曉龍，2009，2010；陳瀟航等，2018)。

1.3.2 殺菌劑對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響 采用分生孢子萌發(fā)抑制法(謝婉鳳等，2014)，將供試藥劑配制成0.333、0.250、0.200、0.167、0.143 mg·L-1濃度梯度，與分生孢子懸浮液等體積混合，移液器吸取30 μL 滴在含PDA 培養(yǎng)基的凹面玻片，無(wú)菌水作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次，培養(yǎng)皿置于25 ℃人工氣候箱恒溫培養(yǎng)，12 h 后隨機(jī)抽取5 個(gè)視野，每視野檢測(cè)孢子20 個(gè)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，按下列公式計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

1.3.3 抑制中濃度EC50的計(jì)算 用抑制中濃度作為殺菌劑毒力比較指標(biāo)，測(cè)定出炭疽病菌對(duì)不同殺菌劑的敏感程度，EC50值越小，表明病原菌對(duì)藥劑的反應(yīng)越靈敏，藥劑的抑制作用越強(qiáng)。根據(jù)抑制率查得幾率值并作為縱坐標(biāo)(y)，各藥劑濃度轉(zhuǎn)化為以10 為底的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)(x)，按幾率值與濃度對(duì)數(shù)之間的線性回歸關(guān)系求得毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)r、P值(范曉龍，2010；陳瀟航等，2018)，并計(jì)算EC50(游文莉等，2003)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和計(jì)算，采用SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(范曉龍，2009；洪宜聰，2015)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及分生孢子萌發(fā)的影響

毒力測(cè)定結(jié)果顯示(表1)，4 種供試殺菌藥劑對(duì)雷公藤炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果，同種藥劑濃度越高對(duì)抑制炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)效果越明顯。

表1 不同殺菌劑對(duì)病原分生孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的抑制效果Table 1 Inhibitory effects of different chemical fungicides on conidia germination and mycelial growth

從表2 可以看出，4 種供試殺菌藥劑對(duì)雷公藤炭疽菌絲生長(zhǎng)均具有抑制作用，抑菌效果最強(qiáng)的是多菌靈和苯甲·丙環(huán)唑，EC50分別為0.166 和0.136 mg·L-1；抑菌效果最差的是嘧菌酯，EC50為0.638 mg·L-1。 4 種藥劑對(duì)雷公藤炭疽病菌菌絲的毒力大小依次為:苯甲·丙環(huán)唑＞多菌靈＞腈菌唑＞嘧菌酯。

表3 可以看出，4 種供試殺菌藥劑對(duì)雷公藤炭疽病菌分生孢子萌發(fā)均具有抑制作用，對(duì)分生孢子萌發(fā)抑制效果最好的是多菌靈，EC50為0.164 mg·L-1，抑制效果最差的是嘧菌酯，EC50為0.271 mg·L-1。 4 種藥劑對(duì)雷公藤炭疽菌分生孢子的毒力大小依次為:多菌靈＞腈菌唑＞苯甲·丙環(huán)唑＞嘧菌酯。

表2 藥劑對(duì)雷公藤炭疽病病原菌絲的室內(nèi)毒力測(cè)定Table 2 Inhibitory effects of different chemical fungicide on mycelial growth

表3 不同藥劑對(duì)雷公藤炭疽病菌分生孢子毒力測(cè)定結(jié)果Table 3 Inhibitory effects of different chemical fungicide on conidia germination

抗病品種選育是林木抗病經(jīng)濟(jì)有效的防控措施，但林木抗病品種繁育具有周期長(zhǎng)，技術(shù)條件要求高等特點(diǎn)，因此，生產(chǎn)過(guò)程中林木病害的防治主要以化學(xué)防治為主，一定程度上可有效抑制林木病害的大規(guī)模發(fā)生。 有研究通過(guò)殺菌藥劑對(duì)南方紅豆杉炭疽病病原(Colletotrichun gloeosporioides)進(jìn)行藥效測(cè)定發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是室內(nèi)藥劑篩選還是野外田間藥效測(cè)定，甲基托布津?qū)δ戏郊t豆杉炭疽病具有良好的防治效果(范曉龍，2009；洪宜聰，2015，2017)。 謝昀燁等(2018)對(duì)茶葉炭疽病病原(Colletotrichun gloeosporioides)藥物敏感性測(cè)定結(jié)果表明，250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油、65%代森鋅可濕性粉劑等藥劑對(duì)該病害具有較強(qiáng)的抑制效果。 陳瀟航等(2018)室內(nèi)藥效測(cè)定結(jié)果表明，咪鮮胺對(duì)菩提樹(shù)炭疽病(Colletotrichun gloeosporioides)抑制效果最佳。 本研究結(jié)果表明，供試4 種藥劑對(duì)雷公藤炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果，同種藥劑濃度越高對(duì)抑制炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)效果越明顯。 對(duì)菌絲抑菌效果最強(qiáng)的是多菌靈和苯甲·丙環(huán)唑，EC50分別為0.166 和0.136 mg·L-1；抑菌效果最差的是嘧菌酯，EC50為0.638 mg·L-1。 對(duì)分生孢子萌發(fā)抑制效果最好的是多菌靈，EC50為0.164 mg·L-1，抑制效果最差的是嘧菌酯，EC50為0.271 mg·L-1。

根據(jù)此研究結(jié)果表明，多菌靈和苯甲·丙環(huán)唑這2 種藥劑對(duì)雷公藤炭疽病菌有較好的抑制作用，可進(jìn)一步用于田間防治試驗(yàn)，為進(jìn)一步篩選生產(chǎn)防治使用的殺菌劑提供理論基礎(chǔ)。