花生黃化病致病線蟲的形態(tài)鑒定與分子生物學檢測

廖琳琳， 劉國坤， 程 曦， 張紹升

(福建農林大學植物保護學院， 福建 福州350002)

裝飾中環(huán)線蟲(Mesocriconema ornata)是一種外寄生線蟲，花生是裝飾中環(huán)線蟲的重要寄主作物(張紹升，1999)。 被侵染的花生植株，其根、莢果和果針上會形成褐色壞死斑。 少數傷痕時形成于表面，而壞死的大傷痕則可以深入到組織內。 大量的側根原基和幼根被殺死，導致側根數減少，使植株的地上部生長衰弱，葉色黃化。 美國的佐治亞州將此病稱為“花生黃化病”( Lucet al，2005)。 目前已有研究發(fā)現(xiàn)，在福建省廈門市、福州市、莆田市的花生上分離出一種線蟲，對該線蟲形態(tài)進行測量和觀察后將其鑒定為裝飾中環(huán)線蟲(章淑玲等，2012；李世通，2013)。

近年來，課題組在寧德市霞浦縣的多個花生地塊采集到黃化的花生病株，獲得大量形態(tài)特征一致的環(huán)線蟲。 本試驗通過顯微形態(tài)測量觀察以及分子生物學測定，對這些花生黃花病致病線蟲進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2013—2014 年，在寧德市霞浦縣的花生產區(qū)發(fā)現(xiàn)花生黃化的現(xiàn)象，采集受害花生的根、莢果和根際土壤，并帶回實驗室作進一步檢查。

1.2 線蟲分離與病組織染色

利用改良貝曼漏斗法(張紹升，1999)對采回的花生植株的根系、莢果和根際土壤進行分離，通過病組織染色觀察線蟲的侵染狀態(tài)，染色方法參考Bybdet al(1983)。

1.3 線蟲標本制作與保存

將分離獲得的線蟲置于體視顯微鏡下，挑取成蟲于凹玻片的水滴中，經酒精燈火焰溫熱殺死。 將殺死后的線蟲挑到滴有TAF 固定液的載玻片上制成臨時玻片，用于形態(tài)特征觀察。 取部分線蟲樣本經脫水后制成永久玻片用于保存(張紹升，1999)。

1.4 線蟲的分子生物學鑒定

1.4.1 線蟲DNA 的提取 將單頭雌蟲挑于滅菌的dd H2O 中清洗3 遍。 取20 μL 的WLB 裂解液于200 μL 的PCR 管中，并加1 μL 蛋白酶K 溶液(1.2 mg·L-1)混勻(Williamset al，1992)。 挑取清洗過后的線蟲于混合液中，用挑針壓斷線蟲。 將其置于-20 ℃冰箱中過夜。 然后取出放在PCR 儀中65 ℃溫育1 h，95 ℃10 min，降溫至4 ℃后，將其作為模板加入到反應體系中擴增。

1.4.2 PCR 擴增 ITS 區(qū)擴增:引物為ITS1(5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和ITS2(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)。 采用50 μL 反應體系:25 μL PCR Master Mixture、5 μL DNA 模板、2 μL ITS1 (10 mmol·L-1)、2 μL ITS2 (10 mmol·L-1)、16 μL ddH2O。 擴增程序:95 ℃預變性150 s；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)；72 ℃最后延伸600 s，于12 ℃保存。

D2D3 區(qū)擴增:引物為D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)。 采用50 μL 反應體系:25 μL PCR Master Mixture、5 μL DNA 模板、2 μL D2A (10 mmol·L-1)、2 μL D3B (10 mmol·L-1)、16 μL ddH2O。 擴增程序:94 ℃預變性240 s；94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共36 個循環(huán)；72 ℃最后延伸600 s，于4 ℃保存。

1.4.3 上樣與瓊脂糖凝膠電泳 反應結束后，將1%瓊脂糖凝膠放置在電泳緩沖液為0.5×TBE的電泳槽中。 取5 μL 擴增產物、1 μL 6×loading buffer 和0.2 μL 的核酸染料混合，于凝膠孔中上樣。 在電壓100 V、電流40 mA 下電泳30 min。 電泳結束后，將凝膠放置在全自動凝膠成像儀中觀察、拍照。

1.4.4 PCR 產物純化、克隆和測序分析 PCR 產物送交生工生物工程(上海) 股份有限公司進行純化、克隆和測序。 將測序結果拼接后在NCBI 上進行相似性比對。

2 結果

2.1 癥狀描述

在田間被大量環(huán)線蟲嚴重侵染的花生植株，地上部葉片黃化，表現(xiàn)出生長不良狀。 地下部的根系不發(fā)達，有大片線蟲侵染后形成的壞死斑。 在體視顯微鏡下解剖根系，可以觀察到取食根系的環(huán)線蟲(圖1A、B)。 為了更清楚的觀察線蟲的侵染狀態(tài)，對病組織進行染色，可以看到入侵的環(huán)線蟲(圖1C)。

圖1 裝飾中環(huán)線蟲危害花生的田間癥狀Figure 1 Symptoms of peanut caused by M. ornata

2.2 病原線蟲形態(tài)學鑒定

2.2.1 形態(tài)測量值 寧德霞浦種群♀(n＝25):L(體長)＝498.5±43.8(401.3 ～576.9)μm；Lv(頭端至陰門的距離)＝462.3±41.0(370.2 ～534.8)μm；V.A.(陰門至肛門的距離)＝9.8±2.2(5.4～14.3)μm；St(口針長)＝54.7±2.5(49.9 ～58.7)μm；StC(口針錐體長)＝40.3±1.6(37.0 ～43.2)μm；StB(口針基桿長)＝10.1±1.4(7.0 ～12.2)μm；StKH(口針基球高)＝4.3±0.4(3.6 ～5.0)μm；StKW(口針基球寬)＝8.6±0.5(7.5 ～9.4)μm；DGO(背食道腺開口至口針基部球的距離)＝5.3±0.3(4.8～5.7)μm；EP(排泄孔至頭端距離)＝127.3±5.4(120.7 ～133.6)μm；MEL(中食道球長度)＝27.4±3.4(22.4～31.9)μm；MEW(中食道球寬度)＝17.2±1.4(13.8 ～19.5)μm；OV(卵巢長)＝110.1±15.8(92.6 ～132.8)μm；W(最大體寬)＝42.7±4.9(34.2 ～51.4)μm；VBW(陰門處體寬)＝29.4±3.6(23.9～36.0)μm；ABW(肛門處體寬)＝25.8±3.0(20.5 ～30.6)μm；Tail(尾長)＝25.5±2.3(21.2～30.3)μm；R(體環(huán)總數)＝87.5±2.5(82.0 ～93.0)；Rst(口針基球至頭端的體環(huán)數)＝13.7±0.8(12.0～15.0)；Roes(食道基球末端至頭端的體環(huán)數)＝23.3±1.2(21.0 ～26.0)；Rex(排泄孔至頭端的體環(huán)數)＝25.3±1.3(23.0 ～27.0)；RV(陰門至蟲體末端的體環(huán)數)＝6.8±0.6(6.0～8.0)；Ran(肛門至蟲體末端體環(huán)數)＝5.0±0.5(4.0～6.0)；RVan(陰門至肛門的體環(huán)數)＝1.8±0.4(1.0～2.0)；a(體長/最大體寬)＝11.8±1.3(9.1 ～14.3)；b(體長/頭端至食道與腸連接處的距離)＝4.3±0.2(4.0～4.7)；c(體長/尾長)＝19.8±1.8(17.4 ～24.0)；c′(尾長/肛門處體寬)＝1.0±0.1(0.8 ～1.2)；V/%(頭端至陰門距離/體長×100)＝92.7±0.8(91.3 ～94.2)；St/%(口針長/體長×100)＝11.0±1.0(9.4～13.9)；Lv/VBW(頭端至陰門的距離/陰門處體寬)＝15.9±1.8(12.3～19.6)；EP/%(排泄孔至頭端距離/體長×100)＝25.6±1.0(24.4～26.6)。

2.2.2 形態(tài)特征描述 雌蟲:蟲體粗大、圓筒形，死后體稍向腹面彎曲或僵直；體環(huán)后翻、光滑，體環(huán)數為82 ～93 條(圖2A)。 口針長、強壯，針錐長約為針桿長的4 倍，基部球前緣突起、呈錨狀，自基部球至頭端的體環(huán)數為12 ～15 條；背食道腺開口到口針基部球的距離為4.8 ～5.7 μm；環(huán)型食道，中食道球強大、卵圓形，后食道球較小、梨形，食道腺與腸平截；排泄孔位于食道-腸瓣門后方，約為蟲體自上而下的25%位置，至頭端的體環(huán)數為23 ～27 條(圖2B)。 前伸單生殖腺，卵巢長約為93～133 μm(圖2C)，受精囊橢圓形，充滿精子。 陰門張開，位于蟲體自上而下的93%位置，到尾端的體環(huán)數為6～8 條；肛門開口小，靠近陰門，與陰門隔1 ～2 個體環(huán)的距離；尾鈍圓(圖2D)。

雄蟲:未見。

圖2 裝飾中環(huán)線蟲的顯微形態(tài)特征Figure 2 Morphological characteristics of M. ornata

2.3 病原線蟲分子生物學鑒定

2.3.1 ITS 區(qū)擴增結果與序列比對 將采自花生上的環(huán)線蟲的rDNA-ITS 區(qū)進行擴增，得到約為1 000 bp 的片段(圖3)；經測序，獲得長度為1 022 bp 的序列。 同時，將該序列在BLAST 上比對分析，發(fā)現(xiàn)與其他環(huán)科線蟲區(qū)別開來，序列同源性最高的是Criconemoides brevistylus，為94%；其次是Hemicriconemoides kanayaensis，序列相似性為83%。 由于同源性較低，無法確定該環(huán)線蟲的種類。

2.3.2 D2D3 區(qū)擴增結果與序列比對 將環(huán)線蟲的rDNA-D2D3 區(qū)進行擴增，得到約為750 bp的片段(圖3)；經測序，獲得長度為769 bp 的序列。 同時，將該序列在BLAST 上比對分析，發(fā)現(xiàn)與Mesocriconema xenoplax的rDNA-D2D3 序列相似性最高，為99%。 由此可以得知，該環(huán)線蟲與異盤中環(huán)線蟲(M. xenoplax)同源性最高，可以將該環(huán)線蟲確定為是中環(huán)屬線蟲。

圖3 裝飾中環(huán)線蟲PCR 產物電泳圖Figure 3 PCR product amplified from ITS and D2D3 region of M. ornata

2.4 分類地位

綜合形態(tài)學測量觀察數據及分子生物學測定結果，同時與Nyczepiret al(1988)的描述比對，將本研究的花生環(huán)線蟲鑒定為裝飾中環(huán)線蟲[Mesocriconema ornata(Raski) Luc ＆ Raski]。

3 小結與討論

在福建省寧德市的花生產區(qū)采集到的寄生線蟲，會導致花生植株長勢衰弱，葉色黃化。 對病根進行組織染色，可見線蟲侵染取食根系。 對該病原線蟲進行形態(tài)特征觀察和測量，與裝飾中環(huán)線蟲的原始描述大體一致(Nyczepiret al，1988)。 在測序比對中，與該線蟲的rDNA-ITS區(qū)序列同源性最高的只有94%；而與rDNA-D2D3 區(qū)序列同源性最高的達到99%。 由此可見，環(huán)線蟲的rDNA-D2D3 區(qū)序列更適合作為其種類鑒定的依據之一。 本研究于福建省寧德市分離出該病原線蟲，系我國首次較為完整的觀察和記述裝飾中環(huán)線蟲侵染花生。 目前，福建省已有多個花生產區(qū)發(fā)現(xiàn)裝飾中環(huán)線蟲的侵害(章淑玲等，2012；李世通，2013)，需引起有關部門的重視，及時采取相應的措施防控該病害的蔓延。