Wnt/β-catenin拮抗劑DKK-1在強(qiáng)直性脊柱炎中的研究進(jìn)展

蔡鑫 唐芳 馬武開(kāi) 蔣總 樊梅 金澤旭

【摘 要】 強(qiáng)直性脊柱炎是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，其病理性骨形成的機(jī)制尚未明確，目前治療效果并不理想。Wnt通路抑制劑Dickkopf-1（DKK-1）在強(qiáng)直性脊柱炎疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。通過(guò)綜述DKK-1在強(qiáng)直性脊柱炎成骨中的作用和在血清中表達(dá)的意義，以及中醫(yī)藥干預(yù)強(qiáng)直性脊柱炎取得的研究成果，以期為進(jìn)一步研究探索強(qiáng)直性脊柱炎病理性骨形成的分子機(jī)制和靶向治療提供新的思路。

【關(guān)鍵詞】 脊柱炎，強(qiáng)直性;Wnt信號(hào)通路;DKK-1;骨代謝;中醫(yī)藥;綜述

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率約為0.2%～1.4%[1]。AS主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)炎癥和新骨形成，最終導(dǎo)致脊柱僵硬和喪失活動(dòng)能力，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[2]。AS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，遺傳和環(huán)境因素的相互作用可能是其中的原因之一。雖然當(dāng)前AS的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是效果仍不理想[3]。經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路的激活在AS病理性骨形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，最新研究表明，Dickkopf-1（DKK-1）蛋白與AS發(fā)病過(guò)程關(guān)系密切[4]。

1 Wnt通路和DKK-1生物學(xué)特性

Wnt家族由許多小的、富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白組成，參與調(diào)控各種細(xì)胞活動(dòng)，在發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[5]。Wnt蛋白通過(guò)包括β-catenin在內(nèi)的多個(gè)蛋白復(fù)合物觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。在沒(méi)有Wnt蛋白的情況下，β-catenin保持在較低水平，游離的β-catenin被26S蛋白酶體泛素化和降解。含有激酶GSK-3β和酪蛋白激酶-1（CK-1）的蛋白復(fù)合物，連同架構(gòu)蛋白軸抑制蛋白1（Axin1）、腺瘤性息肉病蛋白（APC）及散亂蛋白介導(dǎo)了β-catenin的降解[6]。這種復(fù)合物磷酸化β-catenin上的特定氨基酸殘基，為F-盒蛋白/E3連接酶復(fù)合物創(chuàng)造對(duì)接位點(diǎn)。因此，抑制β-catenin磷酸化可防止其降解，增加細(xì)胞質(zhì)水平并促進(jìn)核易位，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活靶基因的表達(dá)[7]。DKK-1最初作為一種誘導(dǎo)頭部發(fā)育的分泌性蛋白在1998年被報(bào)道，是Wnt信號(hào)通路的有效抑制劑[8]。隨后的研究報(bào)道了在骨髓瘤細(xì)胞中DKK-1表達(dá)的增加與骨侵蝕呈正相關(guān)，意味著DKK-1可能抑制成骨細(xì)胞的分化或功能[9]。在雜合子DKK-1缺陷小鼠中，可通過(guò)顯著提升成骨細(xì)胞活性而導(dǎo)致骨形成和骨量增多[10]。

2 DKK-1在AS中的作用

AS是一種慢性炎癥性疾病，新骨形成是AS的重要特征，而過(guò)度的新骨形成可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)或脊柱強(qiáng)直。進(jìn)一步的證據(jù)表明，DKK-1不僅與周?chē)P(guān)節(jié)骨重塑相關(guān)，還參與AS典型病理過(guò)程中的骶髂關(guān)節(jié)侵蝕和融合，功能性DKK-1是AS病情進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物，阻斷DKK-1的表達(dá)可促進(jìn)脊柱關(guān)節(jié)融合，但對(duì)于AS患者血清DKK-1表達(dá)水平的研究結(jié)果并不一致[11-12]。

2.1 DKK-1通過(guò)微小核糖核酸（miRNAs）影響AS骨形成 miRNAs是一組長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小RNAs，通過(guò)與靶mRNAs的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，已被證實(shí)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程[13]。AS病理性新骨形成的機(jī)制尚未明確，但有證據(jù)表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑DKK-1在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。有研究指出，AS患者功能性DKK-1（與LRP-6結(jié)合）水平低于正常人，且DKK-1與AS的影像學(xué)嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[15]，而功能性DKK-1的高表達(dá)可抑制AS的新骨形成、骨贅生長(zhǎng)和脊柱強(qiáng)直[16]，阻斷DKK-1則能夠促進(jìn)骨形成和骶髂關(guān)節(jié)及軸向關(guān)節(jié)強(qiáng)直[17]。

miR-146a位于5q33.3染色體上，是免疫系統(tǒng)疾病的重要調(diào)控因子[18]，miR-146a的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與AS相關(guān)，并且在AS患者血清中高表達(dá)，可作為其生物學(xué)標(biāo)志物[19-20]。成纖維細(xì)胞來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞，是關(guān)節(jié)周?chē)Y(jié)締組織中常見(jiàn)的細(xì)胞類(lèi)型，在一定條件下具有成骨分化潛能[21]。AS患者髖關(guān)節(jié)囊組織中miR-146a表達(dá)上調(diào)，DKK-1 mRNA表達(dá)下調(diào)，miR-146a與DKK-1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。研究人員使用AS成纖維細(xì)胞作為模型用于評(píng)估m(xù)iR-146a在AS發(fā)展中的作用和分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染AS成纖維細(xì)胞后，可顯著抑制AS成纖維細(xì)胞的增殖和成骨分化潛能，同時(shí)能誘導(dǎo)AS成纖維細(xì)胞凋亡，而miR-146a過(guò)表達(dá)則發(fā)揮相反的作用，鑒于miR-146a與DKK-1之間的負(fù)相關(guān)性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-146a通過(guò)直接靶向作用于DKK-1的3-UTR，從而抑制DKK-1的表達(dá)[22]。成骨標(biāo)志物（Runx2、ALP）在miR146a缺陷的AS成纖維細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，在miR-146a增強(qiáng)的細(xì)胞中顯著上調(diào)[23]。表明miR-146a缺陷或過(guò)表達(dá)，能通過(guò)調(diào)控DKK-1的表達(dá)從而影響AS成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡和成骨分化潛能。

miR-29a主要通過(guò)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路正向調(diào)控成骨分化，能夠防止糖皮質(zhì)激素引起的大鼠骨質(zhì)疏松和脆性骨折，并且在AS患者中表達(dá)具有顯著差異性[24-25]。

與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者和正常對(duì)照組相比，AS患者miR-29a的表達(dá)特異性顯著升高[26]。miR-29a在腫瘤壞死因子-α（TNF-α）介導(dǎo)的抗骨質(zhì)形成過(guò)程中明顯減少，阻斷TNF-α可以上調(diào)其表達(dá)。作為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)劑的DKK-1和GSK-3β參與炎癥介導(dǎo)的骨破壞，Kremen2、DKK-1及sFRP2是與骨形成相關(guān)的miR-29a的直接靶基因，LI等[25]在此基礎(chǔ)上將GSK-3β鑒定為miR-29a的新靶標(biāo)蛋白，抗miR-29a在蛋白質(zhì)水平上增加DKK-1和GSK-3β的表達(dá)。TNF-α抑制核β-catenin的表達(dá)，這種現(xiàn)象可以通過(guò)增強(qiáng)miR-29a的表達(dá)或降低DKK-1、GSK-3β的水平來(lái)緩解，同時(shí)提高TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性。這表明miR-29a通過(guò)靶向作用于Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK-1和負(fù)調(diào)控蛋白GSK-3β，可能在AS病理性骨形成中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，Wnt信號(hào)的減弱抑制了AS新骨形成，從而抑制了骨贅生長(zhǎng)和脊柱強(qiáng)直。miRNAs通過(guò)靶向作用于Wnt通路拮抗劑DKK-1或GSK-3β，從而增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)活性，對(duì)于探索DKK-1在AS病理生理過(guò)程中的分子機(jī)制和研究更有效的AS治療靶點(diǎn)具有重要意義。但是，由于miRNA可能調(diào)節(jié)下游信號(hào)中多種靶向蛋白質(zhì)，因此在未來(lái)的研究中應(yīng)嘗試探索其他靶標(biāo)蛋白的參與。

2.2 DKK-1在AS患者血清中的表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)，DKK-1與AS病理改變有關(guān)，但是關(guān)于血清DKK-1水平與AS之間關(guān)系的研究結(jié)果并不一

致[27-28]。這可能與AS患者韌帶骨贅形成有關(guān)，伴有韌帶骨贅形成時(shí)DKK-1水平較低，反之則表達(dá)上調(diào)。例如一些研究報(bào)道了AS患者存在DKK-1功能失調(diào)并且血清中表達(dá)較高水平的DKK-1[29-31];然而有學(xué)者報(bào)告了相反的結(jié)果，與健康人相比，DKK-1水平在AS患者血清中明顯降低[32-33]。還有研究報(bào)道AS患者血清DKK-1水平與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）[34-35]。

HUANG等[30]使用ELISA法檢測(cè)Wnt信號(hào)通路DKK-1、GSK-3β、β-catenin在AS患者和健康對(duì)照組血清中的表達(dá)，結(jié)果顯示，GSK-3β、β-catenin在2組中的表達(dá)并沒(méi)有明顯差異，而AS患者血清DKK-1水平則顯著高于對(duì)照組，提示DKK-1可能特異性過(guò)表達(dá)于AS病理過(guò)程。ROSSINI等[32]研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，AS患者血清DKK-1表達(dá)顯著降低，AS患者血清DKK-1水平與脊柱骨密度Z值呈負(fù)相關(guān)，血清DKK-1水平越高，椎體骨折的發(fā)生率亦越高。DKK-1可能與AS發(fā)生骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度有關(guān)，表明血液循環(huán)中DKK-1水平降低促進(jìn)了Wnt信號(hào)過(guò)表達(dá)，在AS病理性骨形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。SAKELLARIOU等[34]研究表明，DKK-1在AS患者與健康人之間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;但隨著AS患者紅細(xì)胞沉降率（ESR）和C-反應(yīng)蛋白（CRP）的增加，DKK-1水平隨之上調(diào)，提示DKK-1不僅與AS病理成骨有關(guān)，還與影響全身骨重建的炎癥相關(guān)，臨床將血清DKK-1水平用于評(píng)估AS患者系統(tǒng)性骨質(zhì)流失或者韌帶骨贅形成的危險(xiǎn)因素具有一定幫助。CRP是應(yīng)用最廣泛的全身炎癥生物標(biāo)志物，改良Stoke強(qiáng)直性脊柱炎脊柱評(píng)分（mSASSS）是評(píng)價(jià)AS影像學(xué)進(jìn)展的推薦指標(biāo)，能較好反映AS患者脊柱關(guān)節(jié)的侵蝕、硬化和融合程度[36-37]。WU等[12]對(duì)23項(xiàng)研究進(jìn)行了薈萃分析，證實(shí)在AS患者和健康人之間血清DKK-1濃度并沒(méi)有明顯差異，但是通過(guò)亞組分析表明，CRP和mSASSS越高的患者血清DKK-1水平更低。提示血清DKK-1在AS患者與健康人之間的表達(dá)雖然不具有差異性，但是可用于反映炎癥程度和影像學(xué)損害進(jìn)展，有潛力作為預(yù)測(cè)骶髂關(guān)節(jié)炎放射學(xué)進(jìn)展和脊柱關(guān)節(jié)韌帶骨贅形成的良好指標(biāo)。DKK-1在AS疾病進(jìn)展中的潛在機(jī)制則需要進(jìn)一步深入研究。

3 中醫(yī)藥上調(diào)AS患者DKK-1的表達(dá)

部分學(xué)者使用中醫(yī)藥治療AS取得了較好效果，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)血清DKK-1的水平而抑制Wnt信號(hào)通路，最終起到緩解AS疾病進(jìn)展的作用。

孔維萍等[38]在一項(xiàng)前瞻性病例研究中納入45例腎虛督寒型AS患者，經(jīng)補(bǔ)腎強(qiáng)督方治療6個(gè)月后，采用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清DKK-1水平較治療前明顯升高，同時(shí)顯著降低AS患者ESR、CRP等炎性指標(biāo)及枕墻距、指地距等病情評(píng)價(jià)指標(biāo)，且治療過(guò)程中未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。蘇小軍等[39]觀察45例肝腎虧虛型AS患者，發(fā)現(xiàn)使用五勞七損方治療能顯著提高AS患者DKK-1水平，表明該方可能通過(guò)發(fā)揮補(bǔ)肝腎、溫督脈的作用而上調(diào)DKK-1，進(jìn)而影響AS病理性成骨過(guò)程。游濟(jì)洲等[40]使用三四祛痹湯聯(lián)合柳氮磺吡啶治療濕熱痹阻型AS患者90例，結(jié)果有效降低了促炎因子白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-18的表達(dá)，顯著升高DKK-1水平，改善AS患者疾病活動(dòng)度，總有效率及各項(xiàng)指標(biāo)的改善均優(yōu)于單獨(dú)使用柳氮磺吡啶的對(duì)照組，提示聯(lián)合該方治療能夠較好促進(jìn)AS患者關(guān)節(jié)活動(dòng)功能的恢復(fù)。

4 小 結(jié)

總之，目前AS發(fā)病過(guò)程中病理性骨形成的機(jī)制尚不明確，臨床療效有限。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路作為調(diào)控骨代謝的關(guān)鍵信號(hào)通路之一，其抑制劑DKK-1在AS的新骨形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也與其疾病活動(dòng)及影像學(xué)進(jìn)展有關(guān)，有潛力作為監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物。當(dāng)前，對(duì)于DKK-1在AS中的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更加深入的研究，或許會(huì)對(duì)AS發(fā)病分子機(jī)制的理解有重要突破。雖然關(guān)于AS患者血清DKK-1水平的研究報(bào)道并不一致，但從另一方面提示了DKK-1在其發(fā)病過(guò)程中的重要意義。應(yīng)用中醫(yī)藥辨證論治AS能取得較好的臨床療效，與上調(diào)DKK-1的表達(dá)相關(guān)，但其具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。相信隨著分子生物信息技術(shù)及研究的逐步推進(jìn)，對(duì)于AS發(fā)病機(jī)制的理解以及靶向治療藥物的研發(fā)將會(huì)步入新的階段。

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收稿日期：2019-07-26;修回日期：2019-09-18