基于非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選影響察哈爾羊肌肉品質(zhì)的重要分子標(biāo)記

謝遇春 奈日樂 楊峰 馬麗娜 米璐 車天宇 郭俊濤 蘇馨 趙存 王志新 李金泉 劉志紅

摘 ?要：為研究察哈爾羊不同部位肌肉蛋白質(zhì)組成差異及差異蛋白功能，通過數(shù)據(jù)信息依賴性獲取與非標(biāo)記蛋白組學(xué)定量技術(shù)，對察哈爾羊背最長肌和臀肌進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和定量分析，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：察哈爾羊背最長肌和臀肌肌肉中共檢測到蛋白質(zhì)1 073 個(gè)，篩選出差異蛋白140 個(gè)，其中背最長肌中高表達(dá)差異蛋白116 個(gè)，低表達(dá)差異蛋白24 個(gè);背最長肌中高表達(dá)差異蛋白GO（gene ontology）功能富集分析結(jié)果表明，在細(xì)胞組分中，富集于細(xì)胞外外泌體中的蛋白質(zhì)最多，其次富集于細(xì)胞膜內(nèi)，在分子功能中，蛋白質(zhì)主要參與分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶活性、RNA結(jié)合和L-乳酸脫氫酶活性過程，在生物學(xué)進(jìn)程中，蛋白質(zhì)主要參與碳水化合物代謝過程、肌節(jié)組織和肌肉收縮過程;通過差異蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作分析發(fā)現(xiàn)，肌纖維組成模塊包括肌球蛋白-11（myosin-11，MYH11）、肌球蛋白-1（myosin-1，MYH1）、肌中線蛋白-1（myomesin-1，MYOM1）、肌球蛋白-2（myosin-2，MYH2）、肌球蛋白-8（myosin-8，MYH8）、肌球蛋白輕鏈激酶-2（myosin light chain kinase-2，MYLK2）、肌球蛋白輕鏈-2（myosin light chain 2，MYL2）、肌鈣蛋白T-3（troponin T-3，TNNT3）、視松蛋白（telethonin，TCAP）和肌球蛋白結(jié)合蛋白C（myosin-binding protein C，MYBPC2）等蛋白質(zhì)，肌球蛋白MYH1、MYH2、MYH8有望成為影響肉品質(zhì)的重要分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：背最長肌;臀肌;差異蛋白;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;GO富集分析

Abstract： In order to study the difference in the protein compositions of different muscles in Chahar sheep and the functions of differential proteins， the identification and quantitative analysis of proteins in Longissimus dorsi and gluteal muscles of Chahar sheep were carried out using information dependent acquisition （IDA） and label-free proteomics based on sequential window acquisition of all theoretical mass spectra （SWATH）. Then， bioinformatics analysis was performed. A total of 1 073 proteins were detected in the two muscles including 140 differential proteins. In total， 116 up-regulated and 24 down-regulated proteins were found in Longissimus dorsi. Gene ontology and pathway enrichment analysis showed that the up-regulated proteins were most abundant in the exosome followed by the cell membrane; they were mainly involved in the molecular functions of intramolecular transferase activity， RNA binding and L-lactate dehydrogenase as well as in the biological processes of carbohydrate metabolism， sarcomere and muscle contraction. The network interaction of these differential proteins showed that 11 protein modules were found， including myosin-11 （MYH11）， myosin-1 （MYH1）， myomesin-1 （MYOM1）， myosin-2 （MYH2）， myosin-8 （MYH8）， myosin light chain kinase-2 （MYLK2）， myosin light chain 2 （MYL2）， troponin T-3 （TNNT3）， telethonin （TCAP）， myosin-binding protein C （MYBPC2）. MYH1， MYH2 and MYH8 are expected to be important molecular markers affecting meat quality.

Keywords： Longissimus dorsi; Gluteus; differential protein; high performance liquid chromatography-mass spectrometry; GO analysis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190806-175

中圖分類號：TS251.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ? ? ?文章編號：

察哈爾羊生長于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正鑲白旗、鑲黃旗和鑲藍(lán)旗地區(qū)，其母本為內(nèi)蒙古地區(qū)的細(xì)毛羊，父本為德國進(jìn)口的美利奴羊，是我國自上世紀(jì)90年代開始培育的肉毛兼用綿羊新品種[1-2]。察哈爾羊4～6 月齡生長較快，6～18 月齡日增體質(zhì)量開始降低，其日增體質(zhì)量最高可達(dá)166.17 g，產(chǎn)肉性能較高[3]。察哈爾羊羊肉肉嫩多汁，脂肪含量適中，必需脂肪酸亞油酸含量較高，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用[4]。蛋白質(zhì)是肌肉的重要組成部分，其發(fā)生改變會(huì)引發(fā)肌肉質(zhì)量的轉(zhuǎn)變[5-6]。不同部位肌肉的理化特性及蛋白質(zhì)組成不同[7]。肉色、系水力、肌內(nèi)脂肪含量、pH值及嫩度等肉質(zhì)評估標(biāo)準(zhǔn)會(huì)受到肌纖維類型及比例的影響[8-10]。已有研究表明，Ⅰ型及Ⅱa型肌纖維數(shù)量越高，肌肉質(zhì)量越好[11]，相反地，Ⅱb（Ⅱx）型肌纖維含量越高，肉質(zhì)越差[12-14]，即肌纖維類型和比例不同最終會(huì)影響肌肉品質(zhì)。SWATH（sequential window acquisition of all theoretical）非標(biāo)記蛋白組學(xué)定量技術(shù)是一種利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立的快速、獨(dú)立的數(shù)據(jù)采集方法，允許完整和永久地記錄生物樣體中肽前體中所有可檢測的碎片離子[15-16]。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于比較豬肉背最長肌和腰大肌之間的蛋白質(zhì)組差異[17]。

肌肉中的蛋白質(zhì)變化會(huì)導(dǎo)致肉類質(zhì)量的變化。羊肉中不同部位肌肉的理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)組成存在差異，但相關(guān)研究較少。有關(guān)肌肉質(zhì)量的研究多集中在感官、理化（嫩度、pH值、多汁性等）性質(zhì)及營養(yǎng)成分等方面[18-19]，對不同部位肌肉質(zhì)量功能的直接體現(xiàn)者，即肌肉蛋白質(zhì)組成報(bào)道極少。

本研究從蛋白質(zhì)組學(xué)角度出發(fā)，運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究察哈爾羊不同部位肌肉的蛋白質(zhì)組成差異，并且以肌纖維類型對肉質(zhì)的影響為基礎(chǔ)，尋找不同部位肌肉中影響肉品質(zhì)的肌纖維結(jié)構(gòu)蛋白，對其功能進(jìn)行分析，為尋找察哈爾羊肌肉品質(zhì)相關(guān)的分子標(biāo)記提供參考。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣本由同一放牧條件下生長狀況良好的3 只6 月齡察哈爾公羊作為生物重復(fù)，分別采集3 只羊的背最長肌和臀肌。

蛋白裂解液、尿素、胰蛋白酶、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、碳酸氫銨 ? 美國賽默飛世爾公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 ? 北京碧云天生物科技有限公司。

1.2 ? 儀器與設(shè)備

-80 ℃冰箱 ? 海爾集團(tuán)公司;98-111N超聲粉碎儀 ? 寧波新芝生物科技股份有限公司;Z323K低溫離心機(jī) ? 德國Hermle公司;QT-901渦旋儀 ? 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Eksigent nanol 400液相色譜儀、TOF-5600質(zhì)譜儀 ? 美國AB Sciex公司。

1.3 ? 方法

1.3.1 ? 總蛋白提取

將肌肉樣本于液氮中研磨成粉末后，取0.8 g于離心管中，加入1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉裂解液，每隔1 min在渦旋儀上渦旋30 s，20 min后結(jié)束;將樣品用超聲儀破碎2 min后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清;使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行總蛋白濃度測定。

1.3.2 ? 總蛋白酶解

取蛋白含量100 ?g的樣品，加入200 ?L 8 mol/L尿素、10 mmol/L二硫蘇糖醇的混合溶液，37 ℃變性1 h，12 000 r/min離心40 min，加入200 ?L尿素，振蕩、12 000 r/min離心30 min，重復(fù)2 次;加入200 ?L 50 mmol/L碘乙酰胺避光反應(yīng)30 min，12 000 r/min離心30 min;加入100 ?L 100 mmol/L碳酸氫銨，12 000 r/min離心20 min，重復(fù)3 次;加入適量胰酶37 ℃孵育過夜，12 000 r/min離心30 min;加入50 ?L 100 mmol/L碳酸氫銨，12 000 r/min離心30 min，重復(fù)2 次;收集濾液，凍干，備用。

1.3.3 ? 總蛋白鑒定

用50 ?L體積分?jǐn)?shù)2%乙腈水溶液復(fù)溶酶解后的凍干粉，利用數(shù)據(jù)信息依賴性獲取（information dependent acquisition，IDA）與SWATH方法上機(jī)鑒定總蛋白與差異蛋白。離子源：IDA掃描正離子模式，噴霧電壓2.3 kV，離子源溫度150 ℃。蛋白鑒定方式[20]：一級掃描方式：全掃描;一級掃描范圍：m/z 150～1 200;質(zhì)譜分辨率設(shè)為30 000;窗口0.4 Da;碎裂方式：誘導(dǎo)碰撞解離;碎裂能量：動(dòng)態(tài)碎裂;二級掃描范疇：m/z 100～1 500;循環(huán)方式：動(dòng)態(tài)排除掃描;動(dòng)態(tài)排除時(shí)間18 s;SWATH定量方式：一級掃描方式：全掃描;一級掃描范圍：m/z 150～1 200;質(zhì)譜分辨率設(shè)為30 000;間隔窗口25 u（如m/z 400～425、424～449、448～473，…，1 175～1 200）;碎裂方式：誘導(dǎo)碰撞解離;碎裂能量：動(dòng)態(tài)碎裂;二級掃描范疇：m/z 100～1 500;循環(huán)方式：依次均勻掃描。

1.4 ? 數(shù)據(jù)處理及分析

1.4.1 ? 蛋白質(zhì)鑒定

利用Protein Pilot 4.5軟件（AB Sciex公司）對采集的背最長肌和臀肌IDA數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫，蛋白數(shù)據(jù)庫來源于Uniprot/Swiss-Prot（https：//www.uniprot.org/uniprot/？query=reviewed：yes）。

保留時(shí)間校準(zhǔn)：利用PeakView 4.5軟件（AB Sciex公司），對背最長肌和臀肌的SWATH數(shù)據(jù)與IDA數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)，做定量分析。

1.4.2 ? 差異蛋白的篩選

通過LOG2（Fold Change）與-LOG10（P Value）值繪制火山圖，且應(yīng)用Marker View軟件（AB Sciex公司），以P Value<0.05、Fold Change>2或<0.5作為閾值篩選背最長肌和臀肌的差異蛋白。

1.4.3 ? GO（gene ontology）富集分析

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）功能注釋一欄對總蛋白和差異蛋白分別在細(xì)胞學(xué)組分、分子功能及生物學(xué)過程方面進(jìn)行分類，使用默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行注釋。

1.4.4 ? 差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用在線生物信息網(wǎng)站String（https：//string-db.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，String網(wǎng)站包含蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相互作用的豐富信息。首先將蛋白質(zhì)全稱上傳到String 10.5以獲取蛋白質(zhì)互作信息，所需的最低互動(dòng)分?jǐn)?shù)設(shè)置為中等置信度（0.7），最后導(dǎo)入到Cytoscape 3.4.0軟件中制作視覺蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖[21]。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 背最長肌與臀肌總蛋白鑒定與功能分析

以UniProt/Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫為背景，對總蛋白進(jìn)行鑒定，初步建立察哈爾羊蛋白質(zhì)表達(dá)譜。由圖1可知，1%假陽性條件下，背最長肌和臀肌中共檢測到蛋白質(zhì)1 073 個(gè)，其中背最長肌中共檢測到877 個(gè)，臀肌中共檢測到897 個(gè)，2 個(gè)部位的總蛋白數(shù)量相近。

對察哈爾羊肌肉總蛋白進(jìn)行GO組分富集分析，由圖2可知：在細(xì)胞組分中，富集于細(xì)胞外外泌體中的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，其次為富集于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)中的蛋白質(zhì)數(shù)量較多;在分子功能中，蛋白質(zhì)主要參與聚RNA結(jié)合、ATP結(jié)合和鈣離子結(jié)合等功能;在生物學(xué)過程中，蛋白質(zhì)主要參與三羧酸循環(huán)、蛋白質(zhì)結(jié)合和細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過程。

2.2 ? 背最長肌與臀肌差異蛋白篩選與鑒定

以P Value<0.05、Fold Change>2或<0.5作為差異蛋白篩選的閾值，篩選背最長肌與臀肌中的差異蛋白。由圖3可知，共篩選出差異蛋白140 個(gè)，在背最長肌中表達(dá)上調(diào)蛋白116 個(gè)，表達(dá)下調(diào)蛋白24 個(gè)。

由圖4可知：對于篩選出的背最長肌中上調(diào)蛋白，在細(xì)胞組分中，富集于細(xì)胞外外泌體中的蛋白質(zhì)數(shù)量最多，其次是富集于細(xì)胞膜的蛋白質(zhì);在分子功能中，蛋白質(zhì)主要具有分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、聚RNA結(jié)合和L-乳酸脫氫酶等活性;在生物學(xué)過程中，蛋白質(zhì)主要參與碳水化合物代謝過程、肌節(jié)組織和肌肉收縮等過程。

2.3 ? 背最長肌與臀肌差異蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果

ACADS. 線粒體短鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶（mitochondrial short-chain specific acyl-coenzyme A dehydrogenase）、ACAT1. 線粒體乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶（mitochondrial acetyl-coenzyme A acetyltransferase）、AGL. 糖原脫支酶（glycogen debranching enzyme）、AK4. 線粒體腺苷酸激酶4（mitochondrial adenylate kinase 4）、AKR1B1. 醛縮酮還原酶家族1成員B1（aldo-keto reductase family 1 member B1）、ALDH4A1. 線粒體δ-1-吡咯-5-羧酸脫氫酶（mitochondrial δ-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase）、ALDOA. 果糖二磷酸醛縮酶A（fructose-bisphosphate aldolase A）、APOA2. 載脂蛋白A-II（apolipoprotein A-II）、CAPN2. 鈣蛋白酶-2催化亞基（calpain-2 catalytic subunit）、CAPNS1. 鈣蛋白酶小亞單位1（calpain small subunit 1）、CAPZB. F-肌動(dòng)蛋白-帽蛋白亞單位β（F-actin-capping protein subunit β）、CASQ2. 鈣素-2（calsequestrin-2）、CAV3. 微囊蛋白-3（caveolin-3）、CCT7. T-復(fù)合蛋白1亞單位eta（T-complex protein 1 subunit eta）、CCT8. T-復(fù)合蛋白1亞單位θ（T-complex protein 1 subunit theta）、COL3A1. 膠原α-1（III）鏈（collagen alpha-1（III） chain）、COL6A1. 膠原α-1（VI）鏈（Collagen alpha-1（VI） chain）、COPS7A. COP9信號體復(fù)合亞單位7a（COP9 signalosome complex subunit 7a）、COQ9. 線粒體泛醌生物合成蛋白COQ9（mitochondrial ubiquinone biosynthesis protein COQ9）、COX4I1. 線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基4亞型1（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1）、DCN. 核心蛋白聚糖（decorin）、DCUN1D1. 類DCN1蛋白1（DCN1-like protein 1）、DDX1. ATP依賴的RNA螺旋酶DDX1（ATP-dependent RNA helicase DDX1）、DHDH. 反式-1，2-二氫苯-1，2-二醇脫氫酶（trans-1，2-dihydrobenzene-1，2-diol dehydrogenase）、EEF2. 延伸因子2（elongation factor 2）、EIF3F. 真核翻譯起始因子3亞單位F（eukaryotic translation initiation factor 3 subunit F）、EIF4H. 真核翻譯起始因子4H（eukaryotic translation initiation factor 4H）、ESD. S-甲酰谷胱甘肽水解酶（S-formylglutathione hydrolase）、FGA. 纖維蛋白原α鏈（fibrinogen alpha chain）、GLRX. 谷胱甘肽-1（glutaredoxin-1）、GOT1. 細(xì)胞質(zhì)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（cytoplasmic aspartate aminotransferase）、GRB2. 生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2）、HNRNPK. 核不均一性核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K）、HNRNPU. 核不均一性核糖核蛋白U（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U）、HSPB6. 熱休克蛋白β-6（heat shock protein beta-6）、HSPD1. 線粒體60 kDa熱休克蛋白（mitochondrial 60 kDa heat shock protein）、HSPG2. 基底膜特異性硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白（basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein）、IDH2. 線粒體異檸檬酸脫氫酶（mitochondrial isocitrate dehydrogenase）、IDH3B. 線粒體異檸檬酸脫氫酶β亞單位（mitochondrial isocitrate dehydrogenase subunit beta）、IPO5. 導(dǎo)入蛋白5（importin-5）、KERA. 角膜蛋白多糖（keratocan）、KLHL41. 類海帶蛋白41（kelch-like protein 41）、KPNA4. α3導(dǎo)入蛋白亞基（importin subunit alpha-3）、KRT10. 角蛋白，I型細(xì)胞骨架10（keratin， type I cytoskeletal 10）、KRT6C. 角蛋白，Ⅱ型細(xì)胞骨架6c（keratin， type II cytoskeletal 6C）、LDHA. L-乳酸脫氫酶A鏈（L-lactate dehydrogenase A chain）、LDHB. L-乳酸脫氫酶B鏈（L-lactate dehydrogenase B chain）、MDH2. 線粒體蘋果酸脫氫酶（mitochondrial malate dehydrogenase）、MPI. 甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶（mannose-6-phosphate isomerase）、MT-CYB. 細(xì)胞色素b（cytochrome b）、MT-ND5. NADH泛醌氧化還原酶鏈5（NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 5）、MYBPC2. 肌球蛋白結(jié)合蛋白c，快速型（myosin-binding protein c， fast-type）、MYH1. 肌球蛋白-1（myosin-1）、MYH11. 肌球蛋白-11（myosin-11）、MYH2. 肌球蛋白-2（myosin-2）、MYH8. 肌球蛋白-8（myosin-8）、MYL2. 肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2心室/心肌亞型（myosin regulatory light chain 2， ventricular/cardiac muscle isoform）、MYLK2. 肌球蛋白輕鏈激酶2骨骼肌/心肌型（myosin light chain kinase 2， skeletal/cardiac muscle）、MYOM1. 肌球蛋白-1（myomesin-1） 、NDUFA12. NADH脫氫酶[泛醌]1α亞單位 6（NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 12）、NDUFA6. NADH脫氫酶[泛醌]1α亞單位6（NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 6）、NDUFB8. 線粒體NADH脫氫酶[泛醌]1β亞單位8（mitochondrial NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 8）、NNT. 線粒體NAD（P）轉(zhuǎn)氫酶（mitochondrial NAD（P） transhydrogenase）、P4HB. 蛋白二硫異構(gòu)酶（protein disulfide-isomerase）、GM1. 磷酸葡萄糖變位酶-1（phosphoglucomutase-1）、PGM2L1. 葡萄糖1，6-二磷酸合酶（glucose 1，6-bisphosphate synthase）、PGM5. 磷酸葡萄糖變位酶類蛋白5（phosphoglucomutase-like protein 5）、PHPT1. 14 kDa磷酸組氨酸磷酸酶（14 kDa phosphohistidine phosphatase）、PLEC. 半乳糖（plectin）、PMP2. 髓鞘P2蛋白（myelin P2 protein）、PPP2R2A. 絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A（serine/threonine-protein phosphatase 2A）、PRELP. 精氨酸（prolargin）、PRKACA. cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位α（cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha）、PRKAR1A. cAMP依賴性蛋白激酶Ⅰ型α調(diào)節(jié)亞單位（cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit）、PRPS2. 磷酸核糖焦磷酸激酶2（ribose-phosphate pyrophosphokinase 2）、PRSS1. 胰蛋白1（trypsin-1）、PSMB2. 蛋白酶體亞單位β2型（Proteasome subunit beta type-2）、PSMC4. 26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞單位6B（26S proteasome regulatory subunit 6B）、PYGM. 糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase）、RAD23A. 紫外線切除修復(fù)蛋白rad23同源物A（ultraviolet excision repair protein RAD23 homolog A）、RAD23B. 紫外線切除修復(fù)蛋白 rad23同源物 B（ultraviolet excision repair protein RAD23 homolog B）、RAP1b. ras相關(guān)蛋白rap-1b（ras-related protein rap-1b）、RBMXL1. RNA結(jié)合基序蛋白，X-Link類似物-1（RNA binding motif protein， X-linked-like-1）、RPL14. 60S核糖體蛋白L14（60S ribosomal protein L14）、RPLP2. 60S酸性核糖體蛋白P2（60S acidic ribosomal protein P2）、RTRAF. RNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯與轉(zhuǎn)運(yùn)因子蛋白（RNA transcription， translation and transport factor protein）、S100A14. 蛋白S100-A14（protein S100-A14）、SAMM50. 分類和組裝組織組成同系物50（sorting and assembly machinery component 50 homolog）、SLC25A11. 線粒體2-氧谷氨酸/蘋果酸載體蛋白（mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein）、SOD1. 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）、SPTBN1. 收縮蛋白β鏈，非紅細(xì)胞1（spectrin beta chain， non-erythrocytic 1）、TCAP. 視松蛋白（telethonin）、TLN2. 踝蛋白2（talin-2）、TMOD4. 原肌球調(diào)節(jié)蛋白4（tropomodulin-4）、TNNT3. 快速骨骼肌肌鈣蛋白T（fast skeletal muscle troponin T）、UQCR10. Cyb-c1復(fù)合物亞基 9（Cyb-c1 complex subunit 9）、USP5. 泛素羧基末端水解酶5（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5）、VCP. 過渡內(nèi)質(zhì)網(wǎng) ATP 酶（transitional endoplasmic reticulum ATPase）、VIM. 波形蛋白（vimentin）、YHEO. 非特異性蛋白質(zhì)、YWHAE. 14-3-3 蛋白質(zhì)ε（14-3-3 protein epsilon）、YWHAG. 14-3-3 蛋白質(zhì) γ（14-3-3 protein gamma）。

由圖5可知，在察哈爾羊背最長肌與臀肌差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中存在5 個(gè)功能模塊，包括：1）MYH11、MYH1、MYOM1、MYH2、MYH8、MYLK2、MYL2、TNNT3、TCAP和MYBPC2等蛋白質(zhì)參與的肌纖維組成模塊（圖5A）;2）RPL2、RPL14、EIF3F、EIF4H、EEF2、CCT7、CCT8、KPNA4和IPO5等蛋白質(zhì)參與的蛋白翻譯與組裝過程（圖5B）;3）血影蛋白α鏈、SPTAN1、AGL、PGM2L1、PYGM、PGM1、LDHA、LDHB、ALDOA、PGK1、MDH2、IDH3B、IDH2、NNT、MPI、PGM5、ESD、PRPS2、ESD和ALDH4A1等蛋白質(zhì)參與的糖分解與合成過程（圖5C）;4）PSMD2、PSMC4、PSMB2、PSME2、RAD23A、RAD23B、COPS7A、VCP和USP5等蛋白質(zhì)參與的泛素化功能模塊（圖5D）;5）COX4I1、NDHFB8、NDUFA12、NDUFA6、MT-CYB、MT-ND5、UQCR10和ATP5F1等蛋白質(zhì)參與的氧化呼吸鏈電子傳遞過程（圖5E）。

3 ? 討 ?論

蛋白質(zhì)是動(dòng)物生理功能的體現(xiàn)者，可以從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度分析與肉質(zhì)相關(guān)的問題，并期望有效控制肌肉質(zhì)量[22]。根據(jù)Doherty等[23]的研究，蛋白質(zhì)成分的變化可能引起肌肉嫩度的變化。如今，蛋白質(zhì)組學(xué)常用于多組樣品之間的蛋白質(zhì)鑒定，篩選與肌肉品質(zhì)相關(guān)的差異蛋白[24]。本研究利用IDA和SWATH技術(shù)[25]，對察哈爾羊背最長肌和臀肌蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性及相對定量分析，挑選背最長肌中的樞紐差異蛋白，并對其進(jìn)行功能分析。

背最長肌中上調(diào)差異蛋白在生物學(xué)進(jìn)程中的功能分析表明：背最長肌高表達(dá)差異蛋白主要參與碳水化合物代謝、肌節(jié)組織和肌肉收縮過程，說明不同部位肌肉中組成肌纖維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)對肉品質(zhì)有一定影響。研究顯示，肌纖維類型是影響肌肉質(zhì)量的因素，并且肌肉質(zhì)量越好，Ⅰ型和Ⅱa型肌纖維數(shù)量比例越高[26-27]。一般肌纖維類型分為Ⅱa型（快肌纖維，紅色肌肉，氧化型肌纖維）、IIb/IIx型（快肌纖維，白色肌肉，糖酵解型肌纖維）和Ⅰ型（慢肌纖維，紅色肌肉，氧化型肌纖維）[28]，而肌纖維類型取決于不同肌球蛋白輕鏈異構(gòu)體的組成[29]。一方面，肌球蛋白輕鏈主要在氧化型肌纖維中表達(dá)，另一方面，肌纖維類型取決于紅、白肌纖維肌球蛋白輕鏈的表達(dá)情況（紅肌纖維多為Ⅰ型纖維）[30]。肌球蛋白分子由6 條鏈組成，包括2 條重鏈和4 條輕鏈[31-32]。在本研究中，察哈爾羊背最長肌和臀肌差異蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果表明，肌纖維組成模塊中包括MYH11、MYH1、MYOM1、MYH2、MYH8、MYLK2、MYL2、TNNT3、TCAP和MYBPC2等與肌肉組成相關(guān)的蛋白質(zhì)及分子，其中包括4 個(gè)肌球蛋白重鏈，分別為MYH11、MYH1、MYH2和MYH8，以及肌球蛋白輕鏈MYL2。Lametsch等[33]通過鈣蛋白酶誘導(dǎo)的肌纖維及肌原纖維蛋白的降解發(fā)現(xiàn)，即使肌原纖維蛋白中肌動(dòng)蛋白及肌球蛋白重鏈發(fā)生輕微降解，也會(huì)影響肉的嫩度。Skarnes等[34]發(fā)現(xiàn)，小鼠中MYH1基因的一個(gè)靶向零突變導(dǎo)致小鼠生長緩慢、肌肉無力、肌肉收縮和松弛異常。Xiong Xinwei等[35]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)研究豬肉品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)MYH1、MYH2、MYH3和MYH13基因與豬肉品質(zhì)緊密相關(guān)。Zhao Chunping等[36]研究表明，MYH8基因是與牛肉嫩度有關(guān)的候選基因。本研究中篩選出的差異肌球蛋白分子，即肌球蛋白重鏈MYH1、MYH2、MYH8有望成為影響肉品質(zhì)的重要分子標(biāo)記。

4 ? 結(jié) ?論

察哈爾羊背最長肌和臀肌中共檢測到蛋白質(zhì)1 073 個(gè)，背最長肌中共檢測到877 個(gè)，臀肌中共檢測到897 個(gè)。共挑選出差異表達(dá)蛋白140 個(gè)，在背最長肌中上調(diào)蛋白116 個(gè)，下調(diào)蛋白24 個(gè)。背最長肌和臀肌差異蛋白主要參與碳水化合物代謝、肌節(jié)組織和肌肉收縮等生物學(xué)過程。在察哈爾羊背最長肌和臀肌差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中存在5 個(gè)功能模塊，分別為肌纖維組成模塊、蛋白質(zhì)翻譯與組裝過程、糖分解與合成過程、蛋白質(zhì)參與泛素化功能模塊及氧化呼吸鏈電子傳遞過程。肌球蛋白分子，即肌球蛋白重鏈MYH1、MYH2、MYH8有望成為影響肉品質(zhì)的重要分子標(biāo)記。

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