九華黃精九蒸九曬炮制過程中總多糖的含量變化研究

胡葉青，胡云飛，吳其國*

（1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽安慶246052；2.合肥市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽合肥230000）

黃精為百合科植物滇黃精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）、黃精 （Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖。安徽九華山地區(qū)的黃精品種為多花黃精，該植物在九華山地區(qū)生長范圍廣泛，在云南、貴州、浙江、山東也有分布，常見于陰濕山坡和溝谷處，但藥材質(zhì)量都不如九華山地區(qū)，為突出其地方特色，取名為九華黃精[1]。安徽的九華黃精品種更是獲批國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[2]。

從古至今黃精的炮制方法有很多，對(duì)黃精的炮制歷史沿革總結(jié)，傳統(tǒng)的炮制方法以九蒸九曬法為主，九華黃精作為一個(gè)地方特色品種，當(dāng)?shù)睾芏嗥髽I(yè)結(jié)合九華山旅游資源通過古法九蒸九曬炮制九華黃精，將其加工成具有地方特色的藥食兩用品種，在市場(chǎng)上比較受歡迎，基于此，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究已顯得比較重要。

多糖是黃精的主要功能性物質(zhì)[3]，現(xiàn)代研究表明黃精多糖具有多種藥理作用。主要包括以下幾個(gè)方面的內(nèi)容。

（1）有研究表明黃精多糖可提高免疫功能，傅圣斌等[4]通過實(shí)驗(yàn)研究表明黃精多糖可以提高免疫抑制模型小鼠的免疫力，肖小妹等[5]研究表明黃精多糖可呈劑量依耐性的提高腎病綜合征患兒紅細(xì)胞免疫功能。

（2）在神經(jīng)系統(tǒng)方面，黃精多糖可以呈濃度依耐性抑制多巴胺神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)多巴胺神經(jīng)元再生作用[6]，黃芳等[7]通過大鼠迷宮實(shí)驗(yàn)證明黃精多糖可提高大鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力，陳辰等[8]研究表明黃精多糖可通過提高抑郁小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量來改善抑郁癥模型小鼠的行為學(xué)。

（3）黃精多糖具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用，雷升萍等[6]研究表明黃精多糖對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

（4）黃精多糖對(duì)肝腎有保護(hù)作用，韓春楊等[10]研究表明黃精多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷有良好的保護(hù)保護(hù)，李超彥等[11]研究表明黃精多糖能改善順鉑（DDP）所致大鼠腎功能損害。

（5）黃精多糖還具有降血糖、抗腫瘤以及抗菌等作用，王藝等[12]研究表明黃精多糖能改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗和癥狀，段華等[13]研究表明黃精多糖通過激活Caspase系統(tǒng)誘導(dǎo)肝癌H22移植瘤細(xì)胞凋亡，李志濤等[14]提取的黃精多糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃球菌均具有明顯的抑制作用。

本研究通過測(cè)定九華黃精九蒸九曬炮制過程中總多糖的含量變化，為九蒸九曬法炮制九華黃精的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

T90+型紫外可見分光光度計(jì)（英國PG INSTRUMENTS公司），XP26型分析天平（德國Mettler toledo公司，精度0.001 mg），HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（山東鄄城創(chuàng)新儀器有限公司）。

1.2 試藥

葡萄糖對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201707，純度：99.9%），蒽酮（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20170222），硫酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為超純水（屈臣氏公司）。

九華黃精栽培品購自池州市大王洞中藥材種植專業(yè)合作社，九華黃精野生品購于池州市九華府金蓮智慧農(nóng)業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 九蒸九曬九華黃精的制備

取野生和栽培九華黃精生藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，每100 kg黃精，用黃酒20 kg。

（1）第1次蒸制、曬干。將黃酒總量的20%，與凈選好的生品九華黃精攪拌均勻，并悶潤至黃酒被藥材吸盡，再蒸制8 h，取出，放在太陽下曬至藥材外皮微干》

4%氟嘧啶草醚+2.5%五氟磺草胺可分散油懸浮劑100毫升/畝用藥后20d對(duì)水稻田稗草和野慈姑株防效分別為100%?？梢钥闯?%氟嘧啶草醚+2.5%五氟磺草胺可分散油懸浮劑100毫升/畝對(duì)稗草防好，對(duì)野慈姑的防效很好。

（2）第2次至第8次蒸制、曬干。均是將上一步的半成品拌入黃酒總量的10%，悶潤至黃酒被藥材吸盡，再取出，放在太陽下曬至藥材外皮微干，反復(fù)操作7次。

（3）第9次蒸制、曬干。將剩余10%黃酒拌入上述經(jīng)8次蒸制、曬干的半成品中，蒸至表面黑漆色且發(fā)亮，取出，曬至表面干燥，即得九華黃精的九蒸九曬炮制品。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取經(jīng)105°C干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品33 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得（每1 mL中含無水葡萄糖0.33 mg）。

2.3 測(cè)定波長的選擇

精密吸取多糖溶液適量，置10 mL具塞刻度試管中，加水至2.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以未加葡萄糖溶液為空白對(duì)照，然后于450～700 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，黃精多糖與蒽酮-濃硫酸反應(yīng)后在635 nm處有最大吸收峰，由此可以確定635 nm為測(cè)定波長。

圖1 蒽酮-硫酸分光光度法的紫外掃描圖譜

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取對(duì)照品溶液 0.l、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置 10 mL具塞刻度試管中，各加水至2.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白。參照紫外-可見分光光度法（通則0401)，在635 nm波長處測(cè)定吸光度。

以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，得線性回歸方程：y=0.003 1 x+0.176 7（r=0.999 0）。

由圖2可知，葡萄糖濃度在16.5～198.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 供試品溶液的制備

取60℃干燥至恒重的本品細(xì)粉約0.20 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇60 mL，置水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘?jiān)盀V紙置燒瓶中，加水60 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，殘?jiān)盁坑脽崴礈?次，每次8 mL，合并濾液與洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，照2.4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法，自“加水至2.0 mL”起，顯色后，分別于 0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 依法測(cè)定吸光度，RSD 為 1.97%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液0.5 mL于10 mL具塞干燥試管中，照2.4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法，自“加水至2.0 mL”起，依法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，RSD為0.62%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取60℃干燥至恒重的九曬九曬九華黃精粉約0.2 g，精密稱定，按2.5項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，平行制備6份供試品溶液，分別精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，照2.4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法，自“加水至2.0 mL”起，依法測(cè)定吸光度。經(jīng)計(jì)算6份供試品溶液的RSD為1.77%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取6份經(jīng)60℃干燥至恒重的九曬九曬九華黃精粉約0.2 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入對(duì)照品溶液適量，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，照2.4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法，自“加水至2.0 mL”起，依法測(cè)定吸光度。計(jì)算平均回收率為98.23%，RSD為2.05%，表明該方法回收率良好。

2.10 樣品溶液的測(cè)定

精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，照2.4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法，自“加水至2.0 mL”起，依法測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，結(jié)果如表1所示。

表1 九華黃精九蒸九曬過程中總多糖含量的變化 （%）

3 總結(jié)與討論

3.1 結(jié)論

通過對(duì)九華黃精的九蒸九曬炮制過程中總多糖的含量測(cè)定可以得出以下結(jié)論。

（1）野生和栽培九華黃精的總多糖隨著蒸制次數(shù)的增加，總多糖的含量均是先增加后減少，栽培九華黃精的總多糖含量由一蒸一曬的18.68%降為九蒸九曬的10.84%，四蒸四曬時(shí)達(dá)到最高31.51%》。

（2）野生九華黃精的總多糖含量由一蒸一曬的22.18%降為九蒸九曬的12.67%，五蒸五曬時(shí)達(dá)到最高32.81%。

3.2 討論

目前，九華黃精炮制多要反復(fù)蒸制，且以“反復(fù)蒸至滋潤黑色”為經(jīng)驗(yàn)指標(biāo)[15]，九蒸九曬這種炮制方法雖然會(huì)導(dǎo)致多糖含量降低，但卻是傳統(tǒng)的經(jīng)典炮制方法，而2015年版《中國藥典》僅規(guī)定了黃精多糖作為其含量限度，這種方法的專屬性不夠，難以反映黃精的質(zhì)量特點(diǎn)[16]。因此，在九華黃精炮制過程中，如何控制蒸制次數(shù)、時(shí)間等，并結(jié)合炮制過程中其它成分的變化，來制定其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行更深入的研究。