雞爪槭ApPSY和ApPDS基因克隆及其表達分析

林榕燕 樊榮輝 陳裕德 羅遠華 鐘淮欽 林 兵

(1福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究中心/福建省特色花卉工程技術研究中心,福建福州 350013；2福建省農(nóng)業(yè)科學院,福建福州 350003)

雞爪槭(Acer palmatum)是槭樹科槭樹屬落葉小喬木,其葉形美觀、葉色多變,具有很高的園林應用價值,在世界范圍廣泛栽培[1]。葉色是雞爪槭觀賞價值的重要因素之一,研究雞爪槭葉片的呈色機理,可為提高其觀賞品質(zhì)和培育雞爪槭新品種奠定基礎。目前,有關雞爪槭葉片呈色機理的研究還處于起步階段,僅局限于色素種類、生理生化物質(zhì)和環(huán)境因素對其的影響[2-5],有關葉片呈色的分子調(diào)控機理的報道尚鮮見[6-7],雞爪槭分子育種的進程相對滯后。

類胡蘿卜素是自然界中廣泛存在的一類天然色素,目前已超過700種天然類胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)[8],其是使花瓣、葉片、果實呈現(xiàn)黃色、橙色或紅色的有機色素[9]。同時類胡蘿卜素在光合組織中是必不可少的結(jié)構(gòu)成分,也是防止光氧化損傷的保護劑。在高等植物中,類胡蘿卜素是通過類異戊二烯途徑合成的,八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)和八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)是類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶。PSY通過縮合兩個牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸得到八氫番茄紅素,是該途徑中的第一個關鍵限速酶,其編碼的基因成為植物類胡蘿卜素基因工程研究中的重要基因[10]。目前在柿子(Diospyros kakiL.)[11]、桂花(Osmanthus fragrans)[12]、小麥(Triticum aestivumL.)[13]等植物中已分離獲得PSY基因。PDS是催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化為ζ-胡蘿卜素的關鍵酶[14],其編碼的PDS基因與PSY、ZDS、LCYb等基因協(xié)調(diào)作用,可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)花或果實中類胡蘿卜素的積累[15]。PDS基因已從觀賞向日葵(HelianthusannuusL.)[16]、矮牽牛 (Petunia hybrida)[17]、鶴望蘭(Strelitzia reginae)[18]等植物中分離獲得。但有關雞爪槭類胡蘿卜素合成途徑中的PSY和PDS基因的分離和鑒定研究鮮見報道。

基于GenBank數(shù)據(jù)庫中還未收錄雞爪槭PSY和PDS基因序列,本研究擬從雞爪槭中克隆PSY和PDS基因,初步分析其基因及編碼蛋白質(zhì)的序列特征,并檢測不同葉色品種及不同發(fā)育時期槭樹葉片中基因的表達情況,以期為進一步研究八氫番茄紅素合成酶和八氫番茄紅素脫氫酶的功能調(diào)控奠定分子基礎,為進一步利用基因工程技術提高雞爪槭的觀賞品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所花卉研究中心種質(zhì)資源圃保存的8個雞爪槭品種為供試材料,分別為黃金槭(葉片金黃色)、蝴蝶舞(綠色斑葉邊緣帶粉紅色)、青鴨(葉片嫩綠色)、橙之夢(橙色葉片邊緣帶淡紅色)、桂(葉片黃綠色)、青枝垂(葉片綠色)、布加迪(葉片紫紅色)和出猩猩(葉片深紅色)。其中黃金槭葉片5個發(fā)育時期分別為芽葉期(葉片橙紅色)、展葉期(黃色葉片邊緣帶橙紅色)、呈色期(葉片金黃色)、小綠期(葉片黃綠色)及綠葉期(葉片綠色)。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞爪槭葉片總RNA提取和cDNA合成 采用通用植物總RNA提取試劑盒(BioTeke,北京)進行總RNA的提??；采用 PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa,日本)進行cDNA第一鏈的合成；5′RACE所需cDNA的逆轉(zhuǎn)錄是在cDNA第一鏈基礎上進行純化和加尾,產(chǎn)物置于-20℃保存。

1.2.2 引物設計及PCR擴增 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中報道的甜橙(Citrus sinensis,NP_001275815.1)、柚子(Citrus maxima,AJT59421.1)、芒果(Mangifera indica,AFE85918.1)、木薯(Manihot esculenta,ACY42664.1)等植物的PSY基因序列,以及柚子(Citrus maxima,AJT59422.1)、甜橙(Citrus sinensis,AEQ29524.1)、甜櫻桃(Prunus avium,XP_021803084.1)、核桃(Juglans regia,XP_018828238.1)、番木瓜(Carica papaya,ABG72807.2)等植物的PDS基因序列,完成2個基因保守區(qū)引物PSY-F/PSY-R和PDS-F/PDS-R的設計。保守區(qū)測序成功后,設計3′RACE的兩條順式特異引物PSY-3′-1/PSY-3′-2 和PDS-3′-1/PDS-3′-2 及5′RACE 的兩條反向特異引物PSY-5′-1/PSY-5′-2和PDS-5′-1/PDS-5′-2。 拼接獲得PSY和PDS基因的cDNA全長,并設計用于 ORF擴增的引物PSYORF-F/PSY-ORF-R和PDS-ORF-F/PDS-ORF-R。本研究所用的引物具體見表1。PCR擴增反應體系為25μL,其中,100 ng·μL-1的模板 cDNA 1.0μL,10 μmol·L-1的上、下游引物各 1.0μL,10×ExTaq Buffer(含 Mg2+)2.5μL,2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 2.0μL,5 U·μL-1TakaRa Ex Taq 0.25μL,ddH2O 補充至25μL。 擴增程序:94℃ 預變性 4 min；94℃ 變性 1 min,引物相應的退火溫度退火45 s,72℃延伸1 min/1 kb,共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測后,回收目的片段,通過連接、轉(zhuǎn)化,挑選陽性克隆送至鉑尚生物技術(上海)有限公司完成測序。

1.2.3 生物信息學分析 采用在線 ExPASy、CBS Prediction Servers、Wolf Psort Prediction、SOPMA 等生物信息學分析軟件對PSY和PDS蛋白質(zhì)進行基本理化性質(zhì)、卷曲結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細胞定位情況和二級結(jié)構(gòu)預測。通過DNAMAN進行序列多重比對分析,并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4Psy.PDS的表達分析 采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara,日本)和 7500 Real-Time PCR System儀(ABI,美國),以Actin為內(nèi)參基因,以雞爪槭品種黃金槭5個不同發(fā)育時期葉片及8個不同葉色品種葉片cDNA為模板,利用引物PSY-RT-F/PSY-RT-R和PDS-RT-F/PSY-RT-R(表1)進行實時熒光定量PCR,檢測PSY基因、PDS基因的相對表達量,每個反應包括3個重復。采用2-△△Ct法[19]計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞爪槭ApPSY基因和ApPDS基因的克隆

經(jīng)PCR擴增,測序結(jié)果得到一條片段大小為818 bp的條帶(圖1),在線BLAST檢索分析序列,發(fā)現(xiàn)該cDNA序列與芒果、甜橙、柚子等植物的PSY基因cDNA序列同源性達86%～87%,初步確定得到的片段序列為雞爪槭PSY基因的保守序列。而后進行5′和3′擴增,測序后得到片段大小為662 bp和798 bp的特異性條帶。拼接這3個片段序列,得到一條長度為1 497 bp的cDNA全長序列,ORF框驗證得到片段大小為1 299 bp的特異性條帶。測序結(jié)果通過GenBank數(shù)據(jù)庫進行在線BLAST,結(jié)果表明,所得片段為PSY基因序列,命名為ApPSY。該cDNA長1 497 bp,包含一個完整的共1 257 bp的ORF,共編碼418個氨基酸,GenBank登錄號為MF289486.1。

經(jīng)保守區(qū)的PCR擴增,獲得一條1 305 bp的特異性條帶(圖1),在線BLAST比對后,該cDNA序列與番木瓜、甜橙、柚子等植物的PDS基因cDNA序列同源性達87%～89%,初步確定得到的片段序列為雞爪槭PDS基因的保守序列。而后進行5′和3′擴增,測序獲得片段大小為799 bp和1 003 bp的特異性條帶。將獲得的片段序列進行拼接,得到一條長度為1 974 bp的cDNA全長序列,根據(jù)拼接結(jié)果設計相應的ORF框驗證引物,擴增得到1 718 bp大小的特異性條帶,測序結(jié)果進行在線BLAST,結(jié)果表明,所得片段為PDS基因序列,命名為ApPDS。該cDNA長1 974 bp,包含一個完整的共1 692 bp的 ORF,共編碼563個氨基酸,GenBank登錄號為MF289485.1。

表1 雞爪槭PSY基因和PDS基因克隆及熒光定量PCR所用引物Table1 The primers used for gene clonina and fluorescent quantitation PCR of PSY and PDS of Acer palmatum

2.2 雞爪槭ApPSY和ApPDS蛋白質(zhì)生物信息學分析

雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)由418個氨基酸組成,分子式C2090H3321N589O614S20,分子量為47 165.14,理論等電點為8.94。該蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成,其中丙氨酸(Ala)所占比重最大,達到10.3%,組氨酸(His)最低,為0.5%。此外,雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為55.11,是一個不穩(wěn)定蛋白質(zhì),其總平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.262,推斷ApPSY蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和卷曲螺旋預測結(jié)果顯示,ApPSY蛋白質(zhì)不含有信號肽,不具有跨膜結(jié)構(gòu),不屬于跨膜蛋白質(zhì),不能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。對PSY蛋白質(zhì)的亞細胞定位進行預測,發(fā)現(xiàn)ApPSY定位于葉綠體(chlo)的可能性最大。利用SOPMA對雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)預測(圖2),ApPSY蛋白質(zhì)以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主,延伸鏈為輔,所占比例分別為58.85%、27.75%和 9.81%,β-轉(zhuǎn)角所占比例最低,為3.59%。

圖1 雞爪槭ApPSY和ApPDS基因的克隆Fig.1 Cloning of ApPSY and ApPDS gene from Acer palmatum

利用生物信息學分析軟件對雞爪槭ApPDS蛋白質(zhì)進行分析,結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)由563個氨基酸組成,分子式C2842H4465N745O814S27,分子量為62 959.84,理論等電點為6.31,原子總數(shù)8 893。該蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成,其中亮氨酸(Leu)所占比重最大,達到11.0%,色氨酸(Trp)最低,為1.6%；不穩(wěn)定系數(shù)為39.14,是一個穩(wěn)定蛋白質(zhì)；GRAVY為-0.128,在第138個氨基酸表現(xiàn)為親水性最強,為-2.667,推測ApPDS蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。此外,ApPDS蛋白質(zhì)不含有信號肽,不具有跨膜結(jié)構(gòu),不屬于跨膜蛋白質(zhì),不能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu),定位于葉綠體(chlo)的可能性最大。由圖2可知,ApPDS蛋白質(zhì)以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主,所占比例分別為38.72%和32.50%；延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角為輔,所占比例分別為18.29%和10.48%。

圖2 雞爪槭ApPSY和ApPDS蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測Fig.2 Predicted secondary structure of the ApPSY and ApPDS protein from Acer palmatum

2.3 雞爪槭ApPSY和ApPDS編碼蛋白質(zhì)的序列比對與進化分析

BLAST比對結(jié)果顯示,雞爪槭ApPSY基因編碼的氨基酸序列與其他植物的同源性均較高,其中,與甜橙(Citrus sinensis,NP_001275815.1)的同源性最高(80%),與柚子(Citrus maxima,AJT59421.1)和葡萄柚(Citrus x paradisi,AAD38051.2)的同源性為79%,與芒果(Mangifera indica,AFE85918.1)和茶樹(Camellia sinensis,AJB84620.1)的同源性均為78%,與羊躑躅(Rhododendron molle,APB08593.1)、木薯(Manihot esculenta,ACY42664.1)、西瓜(Citrulluslanatus,AGT57744.1)的同源性均為75%,與獼猴桃(Actinidia deliciosa,ACO53104.1)、剛果種(Coffea canephora,ABA43898.1)的同源性均為74%,與煙草(Nicotiana tabacum,AHA58684.1)、廣藿香(Pogostemon cablin,AHJ90431.1)、梔子花 (Gardeniajasminoides,AEF59491.1)和桂花 (Osmanthusfragrans,AFK66771.1)的同源性均為73%。利用DNANAN軟件對包括雞爪槭(Acer palmatum,MF289486.1)在內(nèi)的11種植物進行序列多重比對分析,發(fā)現(xiàn)不同植物的PSY之間具有較高的一致性,其一致性達到81.90%(圖3)。

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載14種不同物種的PSY蛋白質(zhì)序列,結(jié)合雞爪槭ApPSY的編碼蛋白質(zhì)序列,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖4可知,序列被分為兩大分支,包括雞爪槭在內(nèi)的7種植物為一個分支,其他8種植物為另一分支。雞爪槭ApPSY與同為無患子目的柚子、葡萄柚和甜橙親緣關系較近,處于同一分支。

圖3 雞爪槭ApPSY氨基酸序列與其他植物多重比對Fig.3 Multiple alignment of the amino acid sequence of ApPSY among Acer palmatum and other plants

圖4 ApPSY系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ApPSY

NCBI在線BLAST比對結(jié)果顯示,ApPDScDNA核酸序列推導的氨基酸序列與其他植物的同源性均較高,與茶樹(Camellia sinensis,AHB32104.1)的同源性最高(87%),與葡萄柚(Citrusxparadisi,AEQ29520.1)的同源性為86%,與柚子(Citrus maxima,AJT59422.1)、 甜橙 (Citrussinensis,AEQ29524.1)、羊躑躅 (Rhododendronmolle,APB08594.1)和長春花(Catharanthusroseus,AGH32499.1)的同源性均為85%,與甜櫻桃(Prunus avium,XP_021803084.1)、核桃(Juglans regia,XP_018828238.1)、番木瓜(Carica papaya,ABG72807.2)、碧桃(Prunus persica,XP_007222459.1)、蘋果(Malus domestica,ANS58097.1)和大豆(Glycine max,NP_001236769.2)的同源性均為83%,與柿樹(Diospyros kaki,ACY78343.1)和梅花(Prunusmume,XP_008222708.1)的同源性均為82%。利用DNANAN軟件對包括雞爪槭(Acer palmatum,MF289485.1)在內(nèi)的13種植物進行序列多重比對分析,發(fā)現(xiàn)這些植物的PDS之間具有較高的一致性,其一致性達到87.10%(圖5)。

圖5 雞爪槭ApPDS氨基酸序列與其他植物多重比對Fig.5 Multiple alignment of the amino acid sequence of ApPDS among Acer palmatum and other plants

圖6 ApPDS系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of ApPDS

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載14個不同物種的PDS蛋白質(zhì)序列,結(jié)合雞爪槭ApPDS的編碼蛋白質(zhì)序列,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖6可知,序列被分為兩大分支,包括雞爪槭在內(nèi)的7種植物為一個分支,其他8種植物為另一分支。雞爪槭ApPDS與柚子、葡萄柚和甜橙的親緣關系較近。

2.4 不同雞爪槭葉色品種葉片ApPSY基因和ApPDS基因的表達情況

以雞爪槭8個不同葉色品種的葉片為材料,檢測ApPSY基因和ApPDS基因的表達水平 (圖7)。在8個不同葉色品種葉片中,ApPSY基因在黃金槭中的相對表達量最高,ApPDS基因則在橙之夢中的相對表達量最高。

圖7 ApPSY和ApPDS基因在不同雞爪槭葉色品種中的相對表達量Fig.7 Relative expression of ApPSY and ApPDS gene in different leaf color varieties of Acer palmatum

2.5 不同發(fā)育時期葉片ApPSY基因和ApPDS基因的表達情況

對ApPSY基因和ApPDS基因在黃金槭5個發(fā)育時期葉片中的表達情況進行檢測(圖8),ApPSY基因和ApPDS基因在不同發(fā)育時期葉片中均有表達,二者的相對表達量均隨著葉片發(fā)育進程呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,ApPSY基因在呈色期的相對表達量最高,ApPDS基因在小綠期的相對表達量最高。

圖8 ApPSY和ApPDS基因不同發(fā)育時期雞爪槭葉片的相對表達量Fig.8 Relative expression of ApPSY and ApPDS gene in different growth periods of Acer palmatum leaves

3 討論

八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)被普遍認為是類胡蘿卜素合成途徑中最重要的一種調(diào)節(jié)酶。大部分的植物僅含有1個PSY基因,而番茄(Solanum lycopersicum)、木薯、煙草等部分植物中則有2個差異表達的PSY基因,玉米(Zea maysL.)、小麥和高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]等則有3個PSY基因[20]。在洋桔梗(Eustoma grandiflorum)中過表達枸杞(Lycium chinenseMiller)的LmPSY基因,提高了轉(zhuǎn)基因洋桔梗葉片中的總類胡蘿卜素含量[21]；用玉米中的PSY基因轉(zhuǎn)化水稻(Oryza sativa),不僅使水稻變成黃金稻,其胚乳中的類胡蘿卜素含量也大幅提升[22]；同樣地,番茄和木薯中的類胡蘿卜素含量增加也與PSY基因表達有著緊密的相關性[23-24]。本研究克隆獲得了雞爪槭ApPSY基因的cDNA序列,具有完整的開放閱讀框,長1 257 bp,共編碼418個氨基酸。同源性分析結(jié)果顯示,雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)序列與甜橙、蜜柑、芒果的PSY蛋白質(zhì)序列同源性較高,分別達80%、79%和78%,確定所獲得基因是雞爪槭ApPSY基因。進化樹分析結(jié)果表明,雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)與同為無患子目的柚子、葡萄柚和甜橙的PSY蛋白質(zhì)親緣關系較近,說明其進化基本符合植物分類學。實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明,隨著黃金槭葉色由紅色變黃色直至綠色的轉(zhuǎn)變過程,ApPSY基因在呈色期(葉片金黃色)表達量最高；在不同葉色品種葉片中,ApPSY基因在黃色品種中的相對表達量最高,隨后依次為橙色、綠色和紅色品種。梁敏華等[25]研究發(fā)現(xiàn),桃(Prunus persicaL.)果實PpPSY基因在黃肉品種發(fā)育組織中的表達水平高于白肉品種；對鶴望蘭[26]、龍膽(Gentiana lutea)[9]的研究也發(fā)現(xiàn),PSY的表達與黃色花的形成有關。由此推測,雞爪槭葉片中ApPSY基因的表達與黃色著色的深淺具有相關性。

八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)同樣是類胡蘿卜素合成途徑中的重要限速酶之一,催化八氫番茄紅素向番茄紅素的轉(zhuǎn)變,是促進類胡蘿卜素不飽和鍵形成的重要調(diào)節(jié)酶[27]。本研究克隆獲得了雞爪槭ApPDS基因的cDNA序列,具有完整的開放閱讀框,長1 692 bp,共編碼563個氨基酸。該序列推導的氨基酸與茶樹、葡萄柚、柚子PDS推導的氨基酸序列的同源性較高,分別達87%、86%和85%,認為所獲得基因是雞爪槭ApPDS基因。研究表明,蘋果MdPDS在著色期套袋果實果皮中的表達量隨果色增加而上升,在果實色澤發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[28]；在甜瓜(Cucumis meloL.)[29]、草莓(Fragaria×ananassaDuch.)[30]果實發(fā)育過程中,PDS基因表達量的變化趨勢與果實中類胡蘿卜素含量變化趨勢相符。此外,PDS基因在火鶴(Authurium andraeanum)[31]、鶴望蘭[18]花器官成色中可能具有調(diào)控作用,說明PDS基因在植物的花和果實的成色過程中均起到重要作用。本研究通過實時熒光定量PCR的方法,檢測了黃金槭葉色變化的5個不同時期及不同葉色品種葉片中ApPDS基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)ApPDS基因在不同發(fā)育時期葉片中的相對表達量先升高后降低,在小綠期表達量最高；在不同葉色品種葉片中,ApPDS基因在橙色品種橙之夢中的相對表達量最高,在其他葉色品種中均有表達,但未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性,推測ApPDS基因需要與其他基因協(xié)調(diào)作用,從而在轉(zhuǎn)錄水平上影響雞爪槭葉片的呈色。

綜上,雞爪槭ApPSY和ApPDS基因序列的獲得為雞爪槭類胡蘿卜素的合成調(diào)控提供了基因信息。對基因的生物信息和表達情況分析,初步確定了基因所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征、進化關系及不同條件下基因的表達水平,為進一步研究ApPSY和ApPDS的功能及其在雞爪槭葉片呈色中作用和調(diào)控機理奠定了分子基礎,也為雞爪槭類胡蘿卜素前體代謝途徑研究提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在雞爪槭葉片中克隆獲得了ApPSY基因和ApPDS基因,ApPSY基因cDNA序列長1 497 bp,編碼418個氨基酸；ApPDS基因cDNA序列長1 974 bp,編碼563個氨基酸。在不同葉色品種葉片中,ApPSY基因在黃金槭中的相對表達量最高,ApPDS基因則在橙之夢中的相對表達量最高；在不同發(fā)育時期葉片中,ApPSY基因和ApPDS基因的相對表達量均隨著葉片發(fā)育進程呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,ApPSY基因在呈色期的相對表達量最高,ApPDS基因在小綠期的相對表達量最高。推測ApPSY基因可能參與到雞爪槭黃色葉的顯色反應,而ApPDS基因在雞爪槭葉片呈色中未發(fā)現(xiàn)明顯的調(diào)控作用,推測其可能需要與其他基因協(xié)調(diào)作用,從而在轉(zhuǎn)錄水平上影響雞爪槭葉片的呈色。本研究結(jié)果為進一步探討ApPSY和ApPDS基因在雞爪槭中的生物學功能奠定了理論基礎。