循環(huán)miRNAs對乙肝患者肝纖維化診斷價值的薈萃分析

路晴晴, 陳敏, 王曉林, 曹仕瓊

路晴晴, 王曉林, 曹仕瓊, 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院消化內(nèi)科 湖北省武漢市 430061

陳敏, 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院急診內(nèi)科 湖北省武漢市 430061

核心提要： 本研究通過薈萃分析, 證實了循環(huán)miRNAs尤其聯(lián)合miRNAs或miRNAs模型, 可作為一種穩(wěn)定、優(yōu)良的生物標(biāo)志物, 用于診斷慢性乙肝相關(guān)肝纖維化, 其中對LC的診斷準(zhǔn)確率高達(dá)93.7%.同時, 也為其他病因所致肝纖維化的診斷提供了有前景的新手段.

0 引言

慢性乙肝(chronic hepatitis B, CHB)病毒感染是全球病毒性肝炎及肝硬化(liver cirrhosis, LC)的主要原因.據(jù)估計,CHB患者總數(shù)超過3.5億, 每年死亡人數(shù)高達(dá)100多萬[1].大多數(shù)CHB患者存在肝纖維化.肝纖維化最初是可逆的, 但如果缺乏早期診斷、及時治療, 將會進(jìn)展至終末期肝病, 如LC、肝衰竭, 甚至肝癌[2].因此, 肝纖維化的準(zhǔn)確診斷在CHB患者的管理和治療中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.miRNAs是一種短的, 包含18-25個核苷酸的非編碼RNA, 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá).近年來, 由于其在分化、發(fā)育、代謝、增殖、凋亡、病毒感染、腫瘤發(fā)生等眾多生物學(xué)過程中所發(fā)揮的重要作用而備受關(guān)注[3-5].既往研究表明, 部分miRNAs的表達(dá)呈階段性依賴性, 不同程度肝纖維化患者的miRNAs表達(dá)譜存在差異[6-8].近年來, 越來越多的學(xué)者嘗試探索循環(huán)miRNAs對CHB相關(guān)肝纖維化的診斷效能, 但結(jié)果并不一致, 受試者工作特征曲線下面積(the area under the receiver operating characteristic curves, AUROC)從0.635至0.99不等[6-13].循環(huán)miRNAs是否可作為CHB相關(guān)肝纖維化的潛在診斷標(biāo)記物一直存在爭議.為了解決這一爭議, 我們進(jìn)行了此項meta分析, 首次全面評估了循環(huán)miRNAs對CHB相關(guān)肝纖維化的診斷效能.

1 材料和方法

1.1 材料 以“serum/plasma/circulating/blood”和“microRNA/miRNA/miR*”和“Hepatitis B/CHB/viral hepatitis*/chronic hepatitis”和“l(fā)iver fibrosis/liver cirrhosis/hepatic fibrosis*”為關(guān)鍵詞, 同時結(jié)合對應(yīng)的主題詞, 檢索建庫至2019年P(guān)ubMed, Cochrane Library以及Embase數(shù)據(jù)庫的所有相關(guān)研究文獻(xiàn), 并對相關(guān)文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)列表進(jìn)行二次擴(kuò)大范圍檢索以防遺漏.文獻(xiàn)檢索對語言和地域不做限制.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究評價了循環(huán)miRNAs對乙肝相關(guān)肝纖維化的診斷性能; (2)以組織病理學(xué)檢查為金標(biāo)準(zhǔn); (3)根據(jù)METAVIR評分系統(tǒng)或Scheuer評分系統(tǒng)或者其他可比較的分期系統(tǒng)對肝纖維化程度進(jìn)行分級; (4)研究包括足夠的數(shù)據(jù)(包括真陽性、假陽性、真陰性、假陰性)來構(gòu)建四格表用于評價診斷性能.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)主題不相關(guān); (2)研究對象為兒童; (3)動物或細(xì)胞實驗; (4)綜述性文獻(xiàn); (5)讀者來信或會議摘要; (6)患者同時合并感染其他肝炎病毒; (7)重復(fù)發(fā)表和報道.

1.2 方法 由兩位研究者(路和王)嚴(yán)格依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)獨立地對研究進(jìn)行選擇, 并從符合條件的研究中提取信息, 這些信息包括第一作者姓名、發(fā)表年份、地區(qū)、樣本量、纖維化評分系統(tǒng)、對照組的組成、miRNAs的類型、纖維化的分期、真陽性數(shù)(true-positive, TP)、真陰性數(shù)(true-negative, TN)、假陽性數(shù)(false-positive, FP)、假陰性數(shù)(false-negative, FN).納入研究的方法學(xué)質(zhì)量根據(jù)診斷準(zhǔn)確性實驗質(zhì)量評價量表(quality assessment of diagnostic accuracy studies, QUADAS)進(jìn)行評估[14].研究人員之間的分歧通過討論達(dá)成共識, 如果共識不能達(dá)成,則由第三名調(diào)查人員(曹)介入作出最終決定.

統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計分析采用Stata 14.0, Meta-Disc 1.4軟件完成.計算合并的敏感度(sensitivity, SE)、特異度(specificity, SP)、陽性似然比(positive likelihood ratios,PLR)、陰性似然比(negative likelihood ratios, NLR)、診斷比值比(diagnostic odds ratios, DOR)及AUROC作為血清miRNAs診斷CHB相關(guān)肝纖維化的效能評價指標(biāo).診斷效能的評價標(biāo)準(zhǔn)：AUROC = 1.00時為完美, AUROC＞0.90時為優(yōu)秀, AUROC＞0.80時為良好,AUROC＜0.80時為中等[15].納入研究的方法學(xué)質(zhì)量評估則是通過Review Manager 5.3軟件完成.應(yīng)用χ2檢驗對各研究間的異質(zhì)性進(jìn)行檢驗, 用不一致性指數(shù)I2評價異質(zhì)性的程度.I2＞50%或I2＞25%,P＜0.01, 表明異質(zhì)性顯著,應(yīng)采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并, 否則應(yīng)選擇固定效應(yīng)模型.采用meta回歸分析和亞組分析探索研究間異質(zhì)性的潛在來源.此外, 利用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)驗證閾值效應(yīng)的存在.Deeks漏斗圖被用來檢測發(fā)表偏倚.P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果及納入研究的基本特征 共檢索到243篇文獻(xiàn), 其中PubMed 64篇、Cochrane 14篇、Embase 163篇,手工檢索2篇.去除59篇重復(fù)文獻(xiàn)后, 通過瀏覽標(biāo)題和摘要去除166篇主題不相關(guān)文獻(xiàn).對余下18篇文獻(xiàn)仔細(xì)閱讀全文, 最終, 6篇文獻(xiàn)共包括15項研究符合要求被納入(圖1).納入研究的基本特征見表1[6-11], 所有研究均發(fā)表于2013-2017年, 共包含1623例乙肝患者.除了1項研究來自日本外, 其余研究均來自中國.研究間使用的組織學(xué)評分系統(tǒng)不完全相同, 其中3項研究使用METAVIR評分系統(tǒng)[7,11], 11項研究使用Scheuer評分系統(tǒng)[6,8,10].早期纖維化被定義為METAVIR評分≤F2, 或Scheuer評分≤S2;進(jìn)展期纖維化被定義為METAVIR評分≥F3或Scheuer評分S3≥F3; LC被定義為METAVIR評分 = F4或Scheuer評分 = S4.

2.2 研究質(zhì)量評估 使用QUADAS-2量表從“病例選擇、指標(biāo)測試、參考標(biāo)準(zhǔn)、流程與進(jìn)展”四個方面對納入研究的方法學(xué)進(jìn)行評估, 結(jié)果如圖2.大部分研究是回顧性的, 盡管部分研究明確了納入病例的具體時段,但沒有一項研究表明病例的選擇是隨機(jī)的或連續(xù)的, 因此, 病例選擇的偏倚風(fēng)險被列為“不清楚”.沒有一項研究事先設(shè)立診斷閾值, 因此, 在這些研究中, 檢驗指標(biāo)的實施和解釋都被標(biāo)記為具有“高”的偏倚風(fēng)險.在參考標(biāo)準(zhǔn)、流程與進(jìn)展方面, 納入薈萃分析的研究均符合所有項目, 因此偏倚風(fēng)險被標(biāo)注為“低”.

2.3 診斷早期肝纖維化 總共9項研究評估了循環(huán)miRNAs對乙肝患者早期肝纖維化的診斷效能.如圖3和表2所示, 合并的敏感度和特異度分別為76%和64%.接下來, 我們繪制了受試者工作特征曲線, 如圖4, AUROC為0.78, 說明循環(huán)miRNAs具有中等程度的準(zhǔn)確性, 可以作為一種有前景的非侵入性的工具用于早期肝纖維化的識別.

2.4 診斷進(jìn)展期肝纖維化 總共4項研究評估了循環(huán)miRNAs對CHB進(jìn)展期肝纖維化的診斷效能.如圖5和表2, 合并的敏感度和特異度分別為79%和81%.SROC曲線如圖6, 使用循環(huán)miRNAs診斷進(jìn)展期肝纖維化的AUROC值高達(dá)0.82, 表明循環(huán)miRNAs對進(jìn)展期肝纖維化具有良好的診斷性能.

表1 納入研究的基本特征

表2 microRNA診斷肝纖維化的診斷效能和亞組分析結(jié)果

2.5 診斷LC 2項研究評估了循環(huán)miRNAs對CHB患者LC的診斷價值.Chen等[8]構(gòu)建了一個包含兩個miRNAs(miR-106b and miR-181b)的診斷工具, 它對CHB相關(guān)的LC具有較高的診斷準(zhǔn)確性, AUROC高達(dá)0.882.在另一項研究中, 一個包含88個miRNAs的診斷模型被用來診斷LC, 在發(fā)現(xiàn)集中, 診斷準(zhǔn)確性為100%, 在驗證集中, 其診斷準(zhǔn)確性仍高達(dá)93.7%[9].這些結(jié)果表明循環(huán)miRNAs,尤其是聯(lián)合miRNAs或miRNAs模型, 是診斷CHB相關(guān)性LC的有前景的標(biāo)志物.然而, 由于研究數(shù)量有限, 且均來自中國人群, 循環(huán)miRNAs對乙肝LC的診斷效能還需要更多大規(guī)模的、精心設(shè)計的、多國家、多中心的臨床研究來進(jìn)一步證實.

2.6 閾值效應(yīng)、異質(zhì)性及發(fā)表偏倚的評估 共15項研究被納入, 異質(zhì)性檢驗結(jié)果顯示：I2＞50%, 這表明納入的研究間存在顯著的異質(zhì)性.因此隨機(jī)效應(yīng)模型被選擇用于數(shù)據(jù)的合并分析.一般來說, 閾值效應(yīng)是診斷性試驗中最常見的異質(zhì)性來源之一.我們通過斯皮爾曼相關(guān)分析確定閾值效應(yīng).如表2所示,P＞0.05, 無統(tǒng)計學(xué)意義, 說明不存在閾值效應(yīng).隨后, 我們根據(jù)組織學(xué)評分系統(tǒng)、對照組的組成及樣本量的大小進(jìn)行了亞組分析, 如表2, 與總體研究結(jié)果相似, 三個亞組的結(jié)果顯示循環(huán)miRNAs對CHB患者的早期肝纖維化均表現(xiàn)出良好的診斷性能,而不受組織學(xué)評分系統(tǒng)、對照組的組成及樣本量大小的影響.漏斗圖不對稱線性回歸檢驗顯示漏斗圖對稱性,表明不存在發(fā)表偏倚(P= 0.19和0.48; 圖7A、7B).考慮到納入的研究數(shù)量有限, 本研究沒有進(jìn)行meta回歸分析.

3 討論

圖1 研究選擇流程圖.

圖2 研究質(zhì)量評估結(jié)果.Patient Selection：病例選擇; Index Test：指標(biāo)測試; Reference Standard：參考標(biāo)準(zhǔn); Flow and Timing：流程與進(jìn)展; Risk of Bias：偏倚風(fēng)險; Applicability Concerns：適用性問題; High：高; Unclear：不清楚; Low：低.

由于缺乏準(zhǔn)確的診斷方法, CHB相關(guān)肝纖維化已成為導(dǎo)致全球肝功能衰竭甚至肝癌的主要原因之一.肝臟活檢一直被認(rèn)為是肝纖維化診斷和分級的金標(biāo)準(zhǔn).然而, 肝活檢的一系列缺陷如樣本誤差大, 出血風(fēng)險高,醫(yī)療負(fù)擔(dān)重, 以及觀察者間的不一致性等限制了其在臨床實踐中的廣泛應(yīng)用[16].此外, 由于無法避免的有創(chuàng)性, 重復(fù)的組織病理學(xué)檢查是不切實際的.因此, 越來越多的研究者致力于探索可靠的, 無創(chuàng)的手段以取代肝活檢.這些無創(chuàng)診斷方式包括基于血清學(xué)指標(biāo)的評分模型, 以及基于肝臟硬度的影像學(xué)成像技術(shù).其中一些血清學(xué)評分模型如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶-血小板計數(shù)比值(aspartate aminotransferase to platelet ratio index, APRI)[17]及纖維化指數(shù)(fibrosis-four index，F(xiàn)IB-4)[18]是基于慢性丙型肝炎患者的數(shù)據(jù)構(gòu)建的, 他們對于CHB患者肝纖維化診斷的適用性仍存在爭議[19].另外一些模型, 包括增強(qiáng)的肝纖維化評分及Fibro Test, 則很難將肝纖維化患者與慢性肝炎患者進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分.過去十年間, 涌現(xiàn)了許多新興的有前景的影像學(xué)技術(shù), 包括瞬時彈性成像(transient electrograph, TE), 剪切波彈性成像(shear wave elastography, SWE), 聲輻射脈沖彈性成像(acoustic radiation pulse imaging, ARFI), 以及磁共振彈性成像(magnetic resonance elastography, MRE)等.既往研究表明這些影像學(xué)技術(shù)對肝纖維化診斷效能良好, 且優(yōu)于實驗室指標(biāo)[20-23].因此, 已被廣泛應(yīng)用于肝纖維化的臨床診斷.然而, 他們價格不菲, 且診斷準(zhǔn)確性易受到諸如肥胖、腹水、急性炎癥、肝淤血、門脈高壓等一系列因素的影響[24,25], 降低了診斷結(jié)果的可信度.因此, 迫切需要一種無創(chuàng)、高效、可重復(fù)的工具用于肝纖維化的準(zhǔn)確診斷和長期監(jiān)測.作為一種非侵襲性的生物標(biāo)志物,循環(huán)miRNAs在診斷肝纖維化方面具有巨大潛力[26].近年來, 越來越多的學(xué)者嘗試探索循環(huán)miRNAs對CHB相關(guān)肝纖維化的診斷性能, 但結(jié)果不一.因此, 我們進(jìn)行了此項薈萃分析, 首次全面評估循環(huán)miRNAs對CHB相關(guān)肝纖維化的診斷價值.

此項薈萃分析納入了來自6篇文獻(xiàn)的15項研究, 共包括1623例CHB患者.大部分研究來自我國人群, 而我國長期以來一直是一個乙型肝炎高發(fā)國家.由于研究間存在異質(zhì)性(I2＞50%), 我們選擇隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并和分析.其中9項研究評估了循環(huán)miRNAs對早期肝纖維化的診斷效能, 結(jié)果顯示合并的敏感度、特異度及AUROC分別為0.76(95%CI：0.69-0.82)、0.64(95%CI：0.47-0.78)和0.78(95%CI：0.74-0.81).4項研究評價了循環(huán)miRNAs對進(jìn)展期肝纖維化的診斷效能, 結(jié)果顯示合并的敏感度、特異度及AUROC分別為0.79(95%CI：0.72-0.85)、0.81(95%CI：0.63-0.91)和0.82(95%CI：0.79-0.85).這些結(jié)果表明, 循環(huán)miRNAs可作為一種穩(wěn)定、優(yōu)良的分子生物標(biāo)志物, 用于診斷CHB相關(guān)肝纖維化, 尤其是晚期纖維化.僅有兩項研究評估了循環(huán)miRNAs對LC的診斷效能, 結(jié)果表明, 循環(huán)miRNAs對CHB相關(guān)LC具有較高的診斷準(zhǔn)確率, AUROC = 0.882, 準(zhǔn)確率高達(dá)93.7%.這些數(shù)據(jù)表明, 循環(huán)miRNAs, 尤其是聯(lián)合miRNAs或miRNAs模型, 是診斷CHB相關(guān)LC的有前景的標(biāo)志物.上述研究結(jié)果也使得通過無創(chuàng)方法監(jiān)測肝纖維化進(jìn)展成為可能.

王：國際數(shù)學(xué)教育大會（ICME）是全球規(guī)模最大、水平最高的數(shù)學(xué)教育的學(xué)術(shù)大會，會議的申辦，的確經(jīng)歷了不平凡的過程．

圖3 使用microRNAs診斷CHB相關(guān)早期肝纖維化的靈敏度和特異度的森林圖.

圖4 使用microRNAs診斷CHB相關(guān)早期肝纖維化的綜合受試者工作特征曲線.

圖5 使用microRNAs診斷CHB相關(guān)進(jìn)展期肝纖維化的靈敏度和特異度的森林圖.

圖6 使用miRNA診斷乙肝相關(guān)早期肝纖維化的綜合受試者工作特征曲線.

圖7 漏斗圖的線性回歸檢驗圖.A：miRNAs診斷早期肝纖維化; B：miRNAs診斷進(jìn)展期肝纖維化.

此項薈萃分析有幾項優(yōu)點.首先, 這是首個全面評估循環(huán)miRNAs對CHB相關(guān)肝纖維化診斷效能的薈萃分析, 并解決了循環(huán)miRNAs是否可以作為CHB相關(guān)肝纖維化的潛在診斷標(biāo)志物的爭議.其次, 研究設(shè)計是根據(jù)PRISMA聲明(系統(tǒng)回顧和薈萃分析的規(guī)范報告條目)完成的[27].此外, 納入的研究的是由兩名研究者根據(jù)嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)獨立進(jìn)行選擇的.然而, 必須指出的是, 我們的研究仍存在一些局限性.首先, 在本薈萃分析中, 納入的研究之間存在顯著的異質(zhì)性.盡管我們實施了各種探索異質(zhì)性的統(tǒng)計分析方法, 遺憾的是,仍未能確定異質(zhì)性的潛在來源.由于各研究間所檢測的miRNAs不完全相同, 我們推測, 異質(zhì)性可能來源于miRNAs類型的差別.其次, 雖然進(jìn)行了系統(tǒng)全面的文獻(xiàn)檢索, 但最終納入薈萃分析的相關(guān)研究數(shù)量仍然不足.他們僅來自兩個國家, 中國和日本.循環(huán)miRNAs在其他國家和地區(qū)診斷CHB相關(guān)肝纖維化的適用性仍未可知.因此, 在循環(huán)miRNAs被作為CHB相關(guān)肝纖維化的診斷工具之前, 需要進(jìn)行一系列大規(guī)模、前瞻性、多中心、多國家的臨床研究以提供高質(zhì)量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù).

綜上所述, 本薈萃分析證實了循環(huán)miRNAs可以作為CHB相關(guān)肝纖維化診斷的潛在生物標(biāo)記物, 尤其對于晚期肝纖維化和LC.未來需要更多的研究探索循環(huán)miRNAs的聯(lián)合應(yīng)用及基于miRNAs的診斷模型的構(gòu)建,使其在臨床應(yīng)用中更加準(zhǔn)確和可行.

文章亮點

實驗背景

乙肝相關(guān)肝纖維化是導(dǎo)致肝功能衰竭及終末期肝病的主要病因, 其早期診斷對慢性肝病的預(yù)后至關(guān)重要.傳統(tǒng)診斷采用組織病理學(xué)檢查, 因其有創(chuàng)性, 不可重復(fù)性,難以普及, 且無法動態(tài)評估治療效果.因此, 臨床上迫切需要一種靈敏、特異、可重復(fù)的無創(chuàng)檢測指標(biāo).近年來, 越來越多的學(xué)者嘗試探索循環(huán)miRNAs對慢性乙肝(chronic hepatitis B, CHB)相關(guān)肝纖維化的診斷價值, 但結(jié)論不一, 循環(huán)miRNAs是否可作為CHB相關(guān)肝纖維化的潛在診斷標(biāo)記物尚存爭議.

實驗動機(jī)

通過對包含1623例CHB患者的15項研究進(jìn)行薈萃分析,全面評估循環(huán)miRNAs對 CHB相關(guān)肝纖維化的診斷價值, 旨在為CHB相關(guān)肝纖維化及其他病因所致肝纖維化的診斷提供有前景的、無創(chuàng)的、可重復(fù)的新手段.

實驗?zāi)繕?biāo)

通過分別評價循環(huán)miRNAs對CHB相關(guān)早期肝纖維化、進(jìn)展期肝纖維化以及肝硬化(liver cirrhosis, LC)等三種不同程度肝纖維化的診斷價值, 為循環(huán)miRNAs在臨床中用于CHB相關(guān)肝纖維化的診斷及分期提供客觀依據(jù).

實驗方法

本研究采用薈萃分析的方法, 嚴(yán)格依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)對研究進(jìn)行選擇, 并根據(jù)QUADAS量表對研究的方法學(xué)進(jìn)行評估, 以保證納入研究的高質(zhì)量.全面評價了循環(huán)miRNAs對 CHB相關(guān)肝纖維化的診斷價值.在此基礎(chǔ)上, 為增加結(jié)論的穩(wěn)定性, 可靠性, 我們進(jìn)行了亞組分析尋找研究間異質(zhì)性的潛在來源, 利用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)否定了閾值效應(yīng)的存在, 使用Deeks漏斗圖證實不存在發(fā)表偏倚.

實驗結(jié)果

本研究共納入1623例CHB患者, 證實了循環(huán)miRNAs對CHB相關(guān)肝纖維化具有良好的診斷效能.其中循環(huán)miRNAs診斷早期肝纖維化的敏感度、特異度及AUROC值分別為0.76、0.64和0.78; 診斷進(jìn)展期肝纖維化的敏感度、特異度及AUROC值分別為0.79、0.81和0.82; 診斷LC的AUROC = 0.882, 診斷準(zhǔn)確性高達(dá)93.7%.

實驗結(jié)論

本研究證實循環(huán)microRNAs對CHB相關(guān)肝纖維化具有良好的診斷效能, 尤其對于進(jìn)展期肝纖維化及LC, 可作為CHB患者肝纖維化診斷的血清標(biāo)記物.

展望前景

循環(huán)microRNAs對CHB相關(guān)肝纖維化診斷效能優(yōu)良, 有望作為肝纖維化的血清標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用于臨床.