LincRNA-p21調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞伊立替康耐藥性

戴丹平, 余靈芝, 葉夢(mèng)飛

戴丹平, 余靈芝, 葉夢(mèng)飛, 臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))臺(tái)州醫(yī)院藥劑科 浙江省臺(tái)州市 317000

核心提要： lincRNA-p21在HCT-8/CPT-11和SW480/CPT-11細(xì)胞中低表達(dá).過(guò)表達(dá)lincRNA-p21能部分逆轉(zhuǎn)HCT-8/CPT-11和SW480/CPT-11細(xì)胞的CPT-11耐藥性并伴隨抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B活性; 敲減lincRNA-p21以上指標(biāo)呈相反結(jié)果.

0 引言

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤, 是全球癌癥患者死亡的常見(jiàn)原因[1].化療是常見(jiàn)的結(jié)腸癌治療手段之一, 但結(jié)腸癌的化療效果常受到化療藥物耐藥性的制約[2].而鑒定逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌化療耐藥的生物標(biāo)志物并闡明潛在的分子機(jī)制有助于開(kāi)發(fā)新的治療結(jié)腸癌的策略[3].伊立替康(camptothecin-11, CPT-11)為晚期結(jié)腸癌的一線用藥,但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間化療后, 往往造成化療耐藥性增加.因此, 深入研究結(jié)腸癌CPT-11耐藥的機(jī)制, 并恢復(fù)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)CPT-11的敏感性, 對(duì)延長(zhǎng)結(jié)腸癌患者的生命時(shí)間具有十分重要的臨床價(jià)值及社會(huì)意義.

長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA-p21(long intergenic noncoding RNA-p21, lincRNA-p21)被稱為p53直接轉(zhuǎn)錄靶,已發(fā)現(xiàn)其在多種人類(lèi)實(shí)體瘤中下調(diào)[4,5], 且lincRNA-p21可以抑制肝癌、肺癌和胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-7].而,lincRNA-p21在結(jié)腸癌中對(duì)化療耐藥性影響的研究尚少.因此本實(shí)驗(yàn)主要研究lincRNA-p21對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CPT-11耐藥性的調(diào)節(jié)作用, 并初步研究其作用機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8和SW480購(gòu)自于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(american type culture collection,ATCC); 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和PRMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司; 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)耦合的二抗和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid disodium, BCA)試劑盒購(gòu)于江蘇碧云天公司; CPT-11粉劑由江蘇恒瑞公司贈(zèng)予; TRIZol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenⅠ購(gòu)于日本Takara公司; 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)、磷酸化PI3K(phospho-PI3K, p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)和磷酸化AKT(phospho-AKT, p-AKT)抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司.PI3K/AKT通路抑制劑LY294002和激動(dòng)劑Recilisib購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express公司; 包含全長(zhǎng)lincRNA-p21的克隆載體(pcDNA-lincRNA-p21)和靶向抑制lincRNA-p21的siRNA(si-lincRNA-p21) (序列為：GAUAGAUAAUGUUCCUCAA)以及pcDNA空載體(pcDNA-vector)和陰性siRNA(siRNA-Negative control, si-NC) (序列為：UUCUCCGAACGUGUCACGU)由上海吉瑪公司合成.

1.2 方法

1.2.1 CPT-11耐藥的細(xì)胞株的誘導(dǎo)與構(gòu)建：按照文獻(xiàn)[8]中描述的方法, 采用藥物持續(xù)接觸濃度遞增法逐步誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞和SW480細(xì)胞對(duì)CPT-11耐藥.取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HCT-8細(xì)胞和SW480細(xì)胞用胰酶消化, 離心后棄上清并重懸, 取約1×106細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞接種于含CPT-11初濃度為5 μmol/L的培養(yǎng)基中, 每48 h后換液一次.同一濃度的藥物反復(fù)處理3代細(xì)胞, 當(dāng)細(xì)胞能維持生長(zhǎng)且存活率大于80%時(shí), 根據(jù)細(xì)胞存活狀況不斷增加藥物濃度, 并依此反復(fù)處理, 直至其能在50 μmol/L的藥物濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng), 命名為HCT-8/CPT-11細(xì)胞和SW480/CPT-11細(xì)胞.使用耐藥細(xì)胞株前, 將其培養(yǎng)在含有25 μmol/L CPT-11的細(xì)胞培養(yǎng)液中持續(xù)培養(yǎng)1 wk.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：HCT-8、SW480、HCT-8/CPT-11和SW480/CPT-11細(xì)胞在含有10%FBS的PRMI-1640培養(yǎng)液中, 置在37 ℃和5%CO2的條件下培養(yǎng), 并且每隔2 d換液一次, 每周用0.25%胰蛋白酶消化傳代.

1.2.3 結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)染：HCT-8/CPT-11和SW480/CPT-11細(xì)胞接種于6孔板中, 貼壁后利用Lipofectamine 3000輔助轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21、si-NC、pcDNA-lincRNA-p21和pcDNA-vector, 6 h后更換為新鮮培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h.細(xì)胞經(jīng)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)確定已經(jīng)轉(zhuǎn)染成功后, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)：使用TRIZol試劑提取待測(cè)細(xì)胞的總RNA, 利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成基因cDNA鏈.以cDNA為模板, 加入SYBR GreenⅠ及引物混合后用7500 Fast Applied Biosystems進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn).LincRNA-p21反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min, 40個(gè)循環(huán)：95 ℃1min, 74 ℃ 30s, 72 ℃ 34s.GAPDH引物(5'-3')：正向引物：GGGAAATTCAACGGCACAGT , 反向引物：AGATGGTGATGGGCTGCCC; lincRNA-P21引物(5'-3')：正向引物：GGGTGGCTCACTCTTCTGGC, 反向引物：TGGCCTTGCCCGGGCTTGTC.以GAPDH為內(nèi)參, 行2-ΔΔCt法進(jìn)行量化lincRNA-p21表達(dá).

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性：細(xì)胞按照4000個(gè)/孔的密度接種于96孔板培養(yǎng)板中, 按照實(shí)驗(yàn)指定的要求, 采用或者不采用LY294002(10 μmol/L)[9]和Recilisib(10 μmol/L)[10]預(yù)處理細(xì)胞30 min, 再采用不同濃度(25, 50, 100,150, 200 μmol/L)[8]CPT-11培養(yǎng)細(xì)胞24 h.實(shí)驗(yàn)達(dá)到終點(diǎn)時(shí)間后, 加入10 μL CCK-8染色液, 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后, 在450 nm處測(cè)定各孔吸光度.

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)：以裂解液(10 mmol/ L Tris-HCl、150 mmol/ L NaCl、0.11% SDS、1%Triton-100、2 μg/mL Aprotinin、2 μg/mL Leupeptin、1 mmol/L PMSF)抽提已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白, BCA法定量蛋白含量.每樣品取20 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳, 然后轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上, 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h, 隨后, 將膜與p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT一抗(稀釋度1：500)在4 ℃溫育過(guò)夜.第二天, 洗滌膜后, 將膜與HRP標(biāo)記的二抗(稀釋度1：10000)一起室溫孵育1 h.洗滌膜后, 使用Tanon GIS凝膠成像系統(tǒng)ECL顯影, 曝光成像.用Image J軟件掃描灰度值, 以GAPDH內(nèi)參灰度值為對(duì)照, 用其比值作圖.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)表示為mean±SD.倆組數(shù)據(jù)比較, 采用成組t檢驗(yàn); 多組間數(shù)據(jù)兩兩比較, 先行方差分析齊性檢驗(yàn), 滿足方差齊的條件下, 運(yùn)用方差分析的后續(xù)檢驗(yàn).P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 CPT-11耐藥細(xì)胞的鑒定 HCT-8細(xì)胞的IC50值為44.62 μmol/L±5.14 μmol/L, HCT-8/CPT-11細(xì)胞的IC50值為172.35 μmol/L±8.26 μmol/L, 耐藥指數(shù)為3.86; SW480細(xì)胞的IC50值為47.83 μmol/L±4.02 μmol/L, SW480/CPT-11細(xì)胞的IC50值為219.64 μmol/L±11.18 μmol/L,耐藥指數(shù)為4.59; 與HCT-8細(xì)胞或SW480細(xì)胞比較, HCT-8/CPT-11細(xì)胞(圖1A)或的SW480/CPT-11細(xì)胞(圖1B)的細(xì)胞活性均明顯升高(P＜0.01).以上結(jié)果表明CPT-11耐藥細(xì)胞構(gòu)建成功.

2.2 CPT-11耐藥細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21表達(dá) 通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)CPT-11耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21相對(duì)表達(dá)量.結(jié)果如圖2顯示, 分別與HCT-8細(xì)胞或SW480細(xì)胞比較, HCT-8/CPT-11細(xì)胞(圖2A)或SW480/CPT-11細(xì)胞(圖2B)中l(wèi)incRNA-p21的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P＜0.01).

2.3 敲低lincRNA-p21增強(qiáng)CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11耐藥性 分別對(duì)HCT-8/CPT-11細(xì)胞或SW480/CPT-11細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21, CCK-8法檢測(cè)敲低lincRNA-p21對(duì)CPT-11耐藥細(xì)胞的敏感性的影響.HCT-8/CPT-11細(xì)胞敲低lincRNA-p21(圖3A)后, 與si-NC組比較, si-lincRNA-p21組HCT-8/CPT-11細(xì)胞在100、150、200 μmol/L CPT-11濃度下的細(xì)胞活性均明顯升高(P＜0.05;P＜0.01;P＜0.001),見(jiàn)圖3B.在SW480/CPT-11細(xì)胞中也得到了類(lèi)似的結(jié)果,見(jiàn)圖3C和3D.以上結(jié)果提示, lincRNA-p21敲低能增強(qiáng)CPT-11耐藥性.

2.4 過(guò)表達(dá)lincRNA-p21促進(jìn)CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11敏感性 分別對(duì)HCT-8/CPT-11細(xì)胞或SW480/CPT-11細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21, CCK-8法檢測(cè)過(guò)表達(dá)lincRNA-p21對(duì)CPT-11耐藥細(xì)胞的敏感性的影響.HCT-8/CPT-11細(xì)胞過(guò)表達(dá)lincRNA-p21(圖4A)后,與pcDNA-vector組比較, pcDNA-lincRNA-p21組HCT-8/CPT-11細(xì)胞在CPT-11處理下的細(xì)胞活性均明顯降低(P＜0.001), 見(jiàn)圖4B.在SW480/CPT-11細(xì)胞中也得到了類(lèi)似的結(jié)果, 見(jiàn)圖4C和4D.以上結(jié)果提示, lincRNA-p21過(guò)表達(dá)能對(duì)CPT-11增敏.

2.5 lincRNA-p21對(duì)PI3K/AKT通路的調(diào)控作用 Western blot檢測(cè)敲低或過(guò)表達(dá)lincRNA-p21對(duì)PI3K/AKT通路的調(diào)控作用：轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21后, 與si-NC組比較, silincRNA-p21組HCT-8/CPT-11細(xì)胞(圖5A)或SW480/CPT-11細(xì)胞(圖5B)中p-PI3K和p-AKT的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P＜0.01).轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21后, 與pcDNA-vector組比較, pcDNA-lincRNA-p211組HCT-8/CPT-11細(xì)胞(圖5C)或SW480/CPT-11細(xì)胞(圖5D)中p-PI3K和p-AKT的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P＜0.01).結(jié)果提示,lincRNA-p21敲低促進(jìn)CPT-11耐藥細(xì)胞p-PI3K和p-AKT的表達(dá), 而lincRNA-p21過(guò)表達(dá)抑制CPT-11耐藥細(xì)胞p-PI3K和p-AKT的表達(dá).

2.6 PI3K/AKT信號(hào)通路參與lncRNA-p21對(duì)CPT-11耐藥性的調(diào)節(jié)作用 LY294002預(yù)處理的轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的CPT-11耐藥細(xì)胞或Recilisib預(yù)處理的轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21的CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)PI3K/AKT通路信號(hào)的影響見(jiàn)圖6.

采用CCK-8檢測(cè)LY294002預(yù)處理的轉(zhuǎn)染silincRNA-p21的CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11敏感性的影響.結(jié)果顯示,與si-lincRNA-p21組比較, si-lincRNA-p21+LY294002組HCT-8/CPT-11細(xì)胞(圖7A)或SW480/CPT-11細(xì)胞(圖7B)分別在100、150、200 μmol/L CPT-11下的細(xì)胞活性均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001).提示, LY294002預(yù)處理能抑制lincRNA-p21敲低對(duì)CPT-11耐藥性的促進(jìn)作用.

采用CCK-8檢測(cè)Recilisib預(yù)處理的轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21的CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11敏感性的影響.結(jié)果顯示, 與pcDNA-lincRNA-p21組比較, pcDNA-lincRNA-p21+Recilisib組HCT-8/CPT-11細(xì)胞(圖7C)或SW480/CPT-11細(xì)胞(圖7D)在CPT-11下的細(xì)胞活性均明顯升高(P＜0.001).結(jié)果提示, Recilisib預(yù)處理能抑制lincRNA-p21過(guò)表達(dá)對(duì)CPT-11增敏作用.

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同提示, PI3K/AKT信號(hào)通路參與lincRNA-p21對(duì)CPT-11耐藥性的調(diào)節(jié)作用.

3 討論

CPT-11耐藥是晚期結(jié)腸癌患者治療失敗的主要原因之一[11].而探索逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌CPT-11耐藥的機(jī)制有助于對(duì)延長(zhǎng)結(jié)腸癌患者的生命時(shí)間.近年研究[6,12,13]發(fā)現(xiàn),lincRNA-p21在非小細(xì)胞肺癌, 食管癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中下調(diào)表達(dá), 而上調(diào)lincRNA-p21抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲.有研究[14]報(bào)道lincRNA-p21具有增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性的作用, 然而lincRNA-p21對(duì)緩解結(jié)腸癌細(xì)胞CPT-11耐藥性的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道.本研究發(fā)現(xiàn), 相對(duì)于結(jié)腸癌親本細(xì)胞, lincRNA-p21在結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞上低表達(dá), 且敲低lincRNA-p21表達(dá)增強(qiáng)結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞的耐藥性, 而過(guò)表達(dá)lincRNA-p21能部分恢復(fù)結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11的敏感性.這一結(jié)果提示, lincRNA-p21是治療結(jié)腸癌CPT-11耐藥潛在的靶點(diǎn).

圖1 通過(guò)CCK-8法對(duì)構(gòu)建的CPT-11耐藥細(xì)胞進(jìn)行鑒定(n = 4).A：鑒定HCT-8/CPT-11細(xì)胞, 與HCT-8細(xì)胞比較, aP = 0.003; B：鑒定SW480/CPT-11細(xì)胞, 與SW480細(xì)胞比較, bP = 0.000.CCK-8：細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8; CPT-11：伊立替康.

圖2 RT-qPCR檢測(cè)CPT-11耐藥細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)(n = 3).A：lincRNA-p21在HCT-8細(xì)胞和HCT-8/CPT-11細(xì)胞中的表達(dá), 與HCT-8細(xì)胞比較, aP = 0.005; B：lincRNA-p21在SW480細(xì)胞和SW480/CPT-11細(xì)胞中的表達(dá), 與SW480細(xì)胞比較, bP = 0.000.RT-qPCR：實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng); CPT-11：伊立替康; lincRNA-p21：長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA-p21.

圖3 LincRNA-p21敲低增強(qiáng)CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11耐藥性(n = 4).A：RT-qPCR鑒定si-lincRNA-p21在HCT-8/CPT-11細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率, 與si-NC組比較, aP = 0.000; B：si-lincRNA-p21轉(zhuǎn)染后, HCT-8/CPT-11細(xì)胞在不同劑量的CPT-11處理24 h下的細(xì)胞活性, 與si-NC組比較, bP = 0.023, cP = 0.006, dP = 0.000; C：RT-qPCR鑒定si-lincRNA-p21在SW480/CPT-11細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率, 與si-NC組比較, eP = 0.000; D：silincRNA-p21轉(zhuǎn)染后, SW480/CPT-11細(xì)胞在不同劑量的CPT-11處理24 h下的細(xì)胞活性, 與si-NC組比較, fP = 0.032, gP = 0.015, hP = 0.000.lincRNA-p21：長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA-p21; CPT-11：伊立替康; RT-qPCR：實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).

圖4 LincRNA-p21過(guò)表達(dá)抑制CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11耐藥性(n = 4).A：RT-qPCR鑒定pcDNA-lincRNA-p21在HCT-8/CPT-11細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率, 與pcDNA-vector組比較, aP = 0.000; B：pcDNA-lincRNA-p21轉(zhuǎn)染后, HCT-8/CPT-11細(xì)胞在不同劑量的CPT-11處理24 h下的細(xì)胞活性, 與pcDNA-vector組比較, bP = 0.000; C：RT-qPCR鑒定pcDNA-lincrna-p21在SW480/CPT-11細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率, 與pcDNA-vector組比較, cP= 0.000; D：pcDNA-lincRNA-p21轉(zhuǎn)染后, SW480/CPT-11細(xì)胞在不同劑量的CPT-11處理24 h下的細(xì)胞活性, 與pcDNA-vector組比較, dP = 0.000.lincRNA-p21：長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA-p21; CPT-11：伊立替康; RT-qPCR：實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).

圖5 LincRNA-p21對(duì)PI3K/AKT通路的調(diào)控作用(n = 3).A：si-lincRNA-p21轉(zhuǎn)染后, Western blot檢測(cè)HCT-8/CPT-11細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表達(dá), 與si-NC組比較, aP = 0.000, bP = 0.002; B：si-lincRNA-p21轉(zhuǎn)染后, Western blot檢測(cè)SW480/CPT-11細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表達(dá), 與si-NC組比較, cP = 0.000, dP = 0.015; C：pcDNA-lincRNA-p21轉(zhuǎn)染后, Western blot檢測(cè)HCT-8/CPT-11細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表達(dá), 與pcDNA-vector組比較, eP = 0.006, fP = 0.003; D：pcDNA-lincRNA-p21轉(zhuǎn)染后, Western blot檢測(cè)SW480/CPT-11細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表達(dá), 與pcDNA-vector組比較, gP = 0.004, hP = 0.001.lincRNA-p21：長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA-p21; CPT-11：伊立替康; PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶; p-PI3K：磷酸化PI3K; AKT：蛋白激酶B; p-AKT：磷酸化AKT.

圖6 LY294002和Recilisib對(duì)敲減或過(guò)表達(dá)lincRNA-p21的CPT-11耐藥細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)活性的影響(n = 3).A和B：LY294002預(yù)處理已轉(zhuǎn)染silincRNA-p21的HCT-8/CPT-11(A)和SW480/CPT-11(B)細(xì)胞后, Western blot檢測(cè)p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表達(dá); C和D：Recilisib預(yù)處理已轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21的HCT-8/CPT-11(C)和SW480/CPT-11(D)細(xì)胞后, Western blot檢測(cè)p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT的蛋白表達(dá).LY294002：PI3K/AKT抑制劑; Recilisib：PI3K/AKT激動(dòng)劑; lincRNA-p21：長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA-p21; CPT-11：伊立替康; PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶; p-PI3K：磷酸化PI3K; AKT：蛋白激酶B; p-AKT：磷酸化AKT.

本研究對(duì)lincRNA-p21調(diào)控結(jié)腸癌CPT-11耐藥的機(jī)制進(jìn)行了探索, 結(jié)果顯示敲低lincRNA-p21促進(jìn)p-PI3K和p-AKT的表達(dá); 而過(guò)表達(dá)lincRNA-p21則抑制p-PI3K和p-AKT表達(dá).而PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[15-16], 并且有已有研究報(bào)道化療耐藥結(jié)直腸癌組織或奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT高表達(dá), 而抑制PI3K/AKT信號(hào)活性能抑制順鉑耐藥性[17].故, 我們推測(cè)lincRNA-p21調(diào)節(jié)CPT-11耐藥性可能與其調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)活性相關(guān).并且本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), PI3K/AKT抑制劑LY294002能逆轉(zhuǎn)lincRNA-p21敲低對(duì)CPT-11耐藥性的促進(jìn)作用, PI3K/AKT激動(dòng)劑Recilisib能抑制lincRNA-p21過(guò)表達(dá)對(duì)CPT-11增敏作用.以上結(jié)果說(shuō)明, lincRNA-p21通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)活性來(lái)調(diào)控CPT-11耐藥性.

另外, 眾所周知PI3K/AKT抑制劑可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移以及逆轉(zhuǎn)多種化療藥物耐藥性[18], 但PI3K/AKT信號(hào)活性同樣也是正常細(xì)胞賴以生存、生長(zhǎng)、代謝與維持功能的重要信號(hào)[19].在正常的組織或細(xì)胞中, PI3K/AKT信號(hào)同樣也處于激活狀態(tài), 而抑制此信號(hào)活性可能會(huì)造成一系列級(jí)聯(lián)的副作用[18,19].另外, 一些研究[20-22]數(shù)據(jù)顯示, 高活性的PI3K/AKT信號(hào)能對(duì)抗老年癡呆、帕金森和抑郁等中樞神經(jīng)疾病, 而PI3K/AKT抑制劑可加重這類(lèi)疾病.目前, 僅有西羅莫司和哌立福新應(yīng)用于臨床, 而其他PI3K/AKT抑制劑仍處于研究階段.而lincRNA-p21不但在眾多腫瘤中下調(diào)[5-7,12,13], 并且也在其他非腫瘤疾病如動(dòng)脈硬化與冠心病等疾病中下調(diào)表達(dá)[23,24], 且上調(diào)lincRNA-p21表達(dá)能一定程度減輕該類(lèi)疾病的進(jìn)展.雖然在本研究中, lincRNA-p21抑制結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)活性, 但若能開(kāi)發(fā)針對(duì)特異性低表達(dá)lincRNA-p21疾病的靶向恢復(fù)lincRNA-p21表達(dá)的制劑, 可能會(huì)避開(kāi)PI3K/AKT抑制劑的不良反應(yīng).這項(xiàng)研究對(duì)于篩選PI3K/AKT抑制劑也起到了一定的啟示作用.當(dāng)然, 靶向恢復(fù)lincRNA-p21表達(dá)是否真能應(yīng)用于PI3K/AKT抑制劑的篩選仍需大量的研究, 畢竟在其他細(xì)胞、組織或不同的處理?xiàng)l件中l(wèi)incRNA-p21也能影響眾多信號(hào)通路活性.

綜上所述, lincRNA-p21是結(jié)腸癌CPT-11耐藥治療的潛在靶點(diǎn), 上調(diào)lincRNA-p21通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞CPT-11耐藥, 從而起到部分恢復(fù)CPT-11化療敏感性的作用.這些發(fā)現(xiàn)可能為結(jié)腸癌CPT-11化療耐藥患者提供了一個(gè)新的生物標(biāo)記物和治療策略.

圖7 PI3K/AKT信號(hào)通路參與lincRNA-p21對(duì)CPT-11耐藥性的調(diào)節(jié)作用(n = 3).A：LY294002預(yù)處理已轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的HCT-8/CPT-11細(xì)胞后, 檢測(cè)在不同劑量的CPT-11處理24 h下的細(xì)胞活性, 與si-lincRNA-p21組比較, aP = 0.000, bP = 0.015, cP = 0.000; B：LY294002預(yù)處理已轉(zhuǎn)染si-lincRNA-p21的SW480/CPT-11細(xì)胞后,檢測(cè)在不同劑量的CPT-11處理24 h下的細(xì)胞活性, 與si-lincRNA-p21比較, dP = 0.034, bP = 0.008, fP =0.000; C：Recilisib預(yù)處理已轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21的HCT-8/CPT-11細(xì)胞后, 檢測(cè)在不同劑量的CPT-11處理24 h下的細(xì)胞活性, 與pcDNA-lincRNA-p21組比較, gP = 0.000; D：Recilisib預(yù)處理已轉(zhuǎn)染pcDNA-lincRNA-p21的SW480/CPT-11細(xì)胞后, 檢測(cè)在不同劑量的CPT-11處理24 h下的細(xì)胞活性, 與pcDNA-lincRNA-p21組比較, hP = 0.000.LY294002：PI3K/AKT抑制劑; Recilisib：PI3K/AKT激動(dòng)劑; lincRNA-p21：長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA-p21; CPT-11：伊立替康; PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶; AKT：蛋白激酶B.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

伊立替康(camptothecin-11, CPT-11)耐藥是晚期結(jié)腸癌患者CPT-11化療失敗的主要原因之一.而探索逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌CPT-11耐藥的機(jī)制對(duì)提高晚期結(jié)腸癌患者的CPT-11化療具有重大意義.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA-p21(long intergenic non-coding RNA-p21, lincRNA-p21)在多種人類(lèi)實(shí)體瘤中下調(diào), 且其可以抑制多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展.而, 關(guān)于lincRNA-p21在結(jié)腸癌中對(duì)CPT-11耐藥性影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討lincRNA-p21在結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞中對(duì)CPT-11化療敏感性的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

構(gòu)建結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞, 并利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)細(xì)胞lincRNA-p21表達(dá).敲減或過(guò)表達(dá)lincRNA-p21后, 通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)法檢測(cè)結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11敏感性的變化; 并通過(guò)Western blot檢測(cè)改變lincRNA-p21表達(dá)對(duì)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)通路活性的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)腸癌CPT-11耐藥細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21低表達(dá).上調(diào)lincRNA-p21表達(dá)增強(qiáng)CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11敏感性并伴隨抑制PI3K/AKT通路活性, 下調(diào)lincRNA-p21表達(dá)降低CPT-11耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11敏感性并伴隨增強(qiáng)PI3K/AKT通路活性.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

lincRNA-p21可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路活性進(jìn)而調(diào)節(jié)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞對(duì)CPT-11敏感性的變化.

展望前景

本研究為結(jié)腸癌CPT-11化療耐藥患者提供了一個(gè)潛在靶點(diǎn)和治療策略.另外, 這項(xiàng)研究對(duì)于篩選PI3K/AKT抑制劑也起到了一定的啟示作用.