黃芪水溶多糖的提取及抗氧化活性研究

鄭丹 謝丹丹 張麗霞

摘 ? ?要：為提高黃芪水溶多糖的提取率，本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，對水提醇沉法提取黃芪水溶性多糖的工藝（料液比、提取溫度、提取時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，其優(yōu)化工藝為料液比1∶15、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間80 min，此條件下黃芪水溶粗多糖提取率為18.60%，純化多糖（糖含量65.23%）提取率為11.21%。為研究所提取的黃芪水溶多糖的抗氧化活性，以Vc作為對照，開展羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O2-）清除試驗(yàn)，結(jié)果表明，水溶粗多糖、純化多糖和Vc對·OH清除率在0.2～1.2 mg·mL-1范圍內(nèi)、對·O2-的清除率在0.5～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，均隨濃度增加呈先升高后降低的趨勢，三者對·OH清除率最大值分別為75.61%（0.8 mg·mL-1），88.49%（1.0 mg·mL-1）和64.47%（1.0 mg·mL-1），對·O2-的清除率最大值分別為74.29%（2.0 mg·mL-1），69.30%（2.5 mg·mL-1）和94.42%（2.0 mg·mL-1），處理間差異均顯著（P<0.05）。由此可見，水提醇沉法提取黃芪水溶性多糖方法可行，且其在抗氧化活性的應(yīng)用方面具有較大的潛力。

關(guān)鍵詞：黃芪;水溶多糖;水提醇沉法;抗氧化活性

中圖分類號：R284.1 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.11.003

Abstract：In order to improve the extraction rate of water-soluble polysaccharide from Astragalus membranaceus， The experiment was conducted with single factor test and orthogonal test to optimize the material liquid ratio， extraction temperature， and extraction time of water-soluble polysaccharide extraction technology from A. membranaceus by water extraction and alcohol precipitation. The optimized process was as follows： ratio of material to liquid was 1∶15， extraction temperature was 90 ℃ and extraction time was 80 min， which the extraction rate of A. membranaceus polysaccharide was 18.60%， and the extraction rate of purified polysaccharide （sugar content 65.23%） was 11.21%. In order to study the antioxidant activity of water-soluble polysaccharide of A. membranaceus， the scavenging experiments of hydroxyl radicals （·OH） and superoxide anion radicals （·O2-） were carried out， Vc was as the control. The results showed that the scavenging rate of water-soluble crude polysaccharide， purified polysaccharide and Vc to ·OH in the range of 0.2～1.2 mg·mL-1 and to ·O2- in the range of 0.5～3.0 mg·mL-1 increased first and then decreased with the increase of concentration. The maximum scavenging rate of the three to ·OH was 75.61% （0.8 mg·mL-1）， 88.49% （1.0 mg·mL-1） and 64.47% （1.0 mg·mL-1）， respectively， while the maximum scavenging rate to ·O2- were 74.29%（2.0 mg·mL-1）， 69.30% （2.5 mg·mL-1） and 94.42% （2.0 mg·mL-1）， respectively， which there were significant differences between treatments（P<0.05）. Therefore， the method of water extraction and alcohol precipitation is feasible to extract water-soluble polysaccharide from A. membranaceus， and it has great potential in the application of antioxidant activity.

Key words： Astragalus membranaceus; water-soluble polysaccharides; water extraction and alcohol precipitation; antioxidant activity

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科黃芪屬多年生草本植物，是常見藥用植物之一[1]，其藥用部分為根部，具有益氣、止汗、利尿除濕、活血消腫以及生肌等功效[2]。多糖是黃芪藥用部分的主要活性物質(zhì)之一，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等功能[3-13]。多糖按酸堿性分為：酸性多糖、堿性多糖、中性多糖;按溶解性分為水溶性多糖、水不溶性多糖[14]。其中，水溶性多糖由葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖組成[15]，具有止汗、抗腫瘤等免疫功能[2]。有關(guān)水溶性多糖的研究已在黃芪、蘆薈、人參、南瓜玉米、高山紅景天等植物中有諸多報(bào)道[16-17]，但傳統(tǒng)的溶劑萃取法有提取時(shí)間長、溫度高、提取率低等缺點(diǎn)。因此，本文采用水提醇沉法提取黃芪水溶性多糖，對自由基進(jìn)行清除試驗(yàn)，探究其抗氧化活性。

本文通過優(yōu)化黃芪水溶多糖的提取工藝獲得高提取率的較純的水溶性多糖，并對其清除·OH和·O2-能力即抗氧化活性[18-19]進(jìn)行研究，旨在為其在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)用黃芪為市售，購于黑龍江省大慶市讓胡路區(qū)普濟(jì)康復(fù)醫(yī)院，烘干至恒質(zhì)量后研磨成粉備用。

試驗(yàn)用無水乙醇、氫氧化鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、三氯乙酸、濃氨水、雙氧水、溴化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、Tris-鹽酸、鄰苯三酚等均為化學(xué)純。

試驗(yàn)用儀器主要包括電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A）、電熱恒溫水浴鍋（HHS）、離心機(jī)（PDZ5-WS）、紫外可見分光光度計(jì)（752N）和恒流泵（BT1-100E）。

1.2 方 法

1.2.1 黃芪水溶多糖的提取工藝優(yōu)化 ?（1）采用水提醇沉法[20]提取黃芪中的水溶性多糖，即按一定料液比在燒杯中加入黃芪粉末和純凈水，水浴加熱提取一定時(shí)間，1/3體積75%乙醇沉降多糖，去除蛋白、色素、陰陽離子，再次1/3體積75%醇沉（共兩次，目的是除去多余的水分），離心后干燥，即為粗多糖。試驗(yàn)開展了不同料液比、提取溫度和提取時(shí)間對多糖提取率影響的單因素試驗(yàn)，再通過正交試驗(yàn)（表1）優(yōu)化上述工藝條件，以提升黃芪水溶多糖提取率。

（2）利用苯酚硫酸法[20-21]測定黃芪水溶粗多糖含量并進(jìn)行多糖提取率計(jì)算。

具體操作：準(zhǔn)確稱取105 ℃烘干至恒質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖50 mg，以蒸餾水定容至500 mL容量瓶中并搖勻，分別取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9和1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加5%苯酚溶液2.5 mL混勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸混勻，沸水浴15 min，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（ A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。按照文獻(xiàn)[22]，得回歸方程A=1.2×10-2C-9×10-3，式中，A為吸光度，C為葡糖糖濃度;方程R2=0.999 8，回歸擬合效果良好。以提取出的黃芪水溶粗多糖或純化多糖替換葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上述試驗(yàn)，測定490 nm的吸光度，重復(fù)3次，根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖或純化多糖含量，則多糖提取率=多糖含量/原料質(zhì)量×100%。

1.2.2 黃芪水溶多糖純化 （1）脫蛋白。取上述粗多糖配成5%的糖溶液，加入等體積的30%三氯乙酸搖勻，置于 4 ℃冰箱，醇沉過夜，然后離心，留上清，再用1 mol·L-1 NaOH溶液中和至pH值=7即可。

（2）脫色素。將脫蛋白后的多糖溶液，用濃氨水調(diào)至pH值=8.0，逐漸滴加20% H2O2至溶液為淺黃色，50 ℃水浴，保溫2 h后過濾。

（3）柱層析。將脫色素后的多糖溶液濃縮至5 mL，采用DEAE-纖維素和瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B柱層析相結(jié)合的方法對水溶粗多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化分離，得到純化的黃芪水溶多糖。

（4）多糖結(jié)構(gòu)檢測。取黃芪水溶粗多糖和純化多糖粉末各2 mg與干燥的KBr在瑪瑙研缽中研磨均勻后壓片，使用傅立葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，檢測多糖結(jié)構(gòu)。

1.2.3 抗氧化活性測定 （1）羥基自由基（·OH）清除試驗(yàn)-Smirnoff法[23]。利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系里加入水楊酸以捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該有色物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。將黃芪粗多糖、純化多糖和Vc（對照）用蒸餾水進(jìn)行稀釋，分別配成一系列濃度梯度的溶液，即0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg·mL-1。將1 mL 9 moL·L-1FeSO4 溶液和2 mL 9 moL·L-1水楊酸-乙醇溶液加入試管，再分別加入不同質(zhì)量濃度的黃芪粗多糖、純化多糖和Vc溶液各2 mL，最后加入2 mL 8.8 moL·L-1H2O2，在37 ℃溫度條件下反應(yīng)30 min，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。以蒸餾水代替粗多糖作空白調(diào)零，在波長510 nm 處測定各處理的吸光度。自由基的清除率的計(jì)算公式：

·OH清除率=（A0-Ax）/A0×100%

式中，A0為空白對照液的吸光度，Ax為加入多糖液的吸光度。

（2）超氧陰離子自由基（·O2-）清除試驗(yàn)—鄰苯三酚自氧化法[23]。取25 ℃水浴中預(yù)熱的0.05 mol·L-1Tris-HCl（pH值=8.2），分別加入不同濃度（0.5，1.0，1.5，2.0，

2.5，3.0 mg·mL-1）水溶粗多糖、純化多糖、Vc（對照）溶液1 mL，再加入25 mmoL·L-1的鄰苯三酚溶液4 mL，迅速搖勻，并立刻于波長325 nm處每隔30 s測一次吸光值，反應(yīng)時(shí)間為3 min，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)?！2-清除率的計(jì)算公式為：

丁利君和吳倩萍[18]、李寶霞等[19]研究表明，黃芪多糖具有一定的抗氧化活性，前者認(rèn)為黃芪多糖對羥自由基（·OH）和超氧自由基（·O2-）的清除率分別在0～1.0 mL和0～3.0 mL范圍內(nèi)與多糖溶液加入量正相關(guān)，后者認(rèn)為在0.05～ 0.25 mg·mL-1范圍內(nèi)，黃芪多糖對·OH的抑制率與濃度正相關(guān)，同時(shí)其對·OH清除能力高于公認(rèn)的抗氧化劑Vc。本研究中，無論是黃芪水溶粗多糖、純化多糖還是Vc對·OH和·O2-的清除率分別在0.2～1.2 mg·mL-1和0.5～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)均隨濃度增加呈先升高后降低的拋物線趨勢，這與丁利君和吳倩萍[18]的研究結(jié)果不同，可能是由于所提取多糖中的具有抗氧化活性的糖含量不同及所采用的劑量單位所致，而與李寶霞等[19]相比較，本研究的多糖及Vc范圍包含了李寶霞等[19]研究中所設(shè)的濃度范圍（0.05～ 0.25 mg·mL-1），且在此范圍內(nèi)本研究中多糖和Vc對·OH的清除率亦呈增加趨勢。

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