CRISPR/Cas 9介導的基質Gla蛋白基因敲除對破骨細胞分化的影響

趙俐婷，王乃寧，賀芳，張燕

CRISPR/Cas 9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-Associated Proteins）系統(tǒng)是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種防御外源性遺傳物質入侵的自身免疫機制［1-2］，能夠識別自身和外源入侵DNA片段。它具有簡單、方便、高效等特點［3-4］，這種新型基因組靶向修飾技術已被廣泛應用［5-8］。通過人工設計tracrRNA/cRNA復合體，形成單鏈向導RNA（guide RNA，gRNA），使Cas 9蛋白對特定的DNA序列進行靶向切割［4］。隨后DNA通過非同源性末端接合或同源性重組，對斷裂的DNA進行修復，發(fā)生替換、移碼或缺失突變，達到基因敲除的目的［9-11］。

基質Gla蛋白（matrix Gla protein，MGP），是最初從牛骨骼中分離出的分子量為14 kD的維生素K依賴性循環(huán)蛋白［12］。MGP廣泛存在于骨［13］、軟骨［14］、牙質［15］等組織中，是調節(jié)骨形成和軟組織鈣化的重要基質蛋白［16］。MGP基因敲除小鼠出生后由于大動脈硬化破裂于6～8周內死亡［17-18］。MGP基因敲除小鼠還表現(xiàn)為軟骨內骨化缺陷，尤其是生長板軟骨，導致體型短小、骨量減少，提示MGP對成骨細胞分化有一定作用［19］。但迄今為止，尚未見到MGP對破骨細胞分化產生作用的報道。本研究于2018年5月至2019年1月利用CRISPR/Cas 9技術構建了MGP基因敲除的RAW264.7巨噬細胞系，為研究MGP在破骨細胞的功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 RAW264.7細胞系（購于中國科學院細胞庫）用含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，293-T細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳，每隔2 d傳代1次。

1.1.2 試劑 質粒提取試劑盒購于北京TIANGEN公司（批號Q5517）、DNA純化試劑盒購于北京TIANGEN公司（批號R6308）、限制性內切酶BsmBI購于美國NEB公司（批號201805028）、T4連接酶購于西安海寧生物有限公司（批號AH70102A）、α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司、FBS購于美國GIBCO公司（批號42F9081K-2023-1）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）購于美國Pepro Tech公司（批號AF-315-03）、核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）購于美國Pepro Tech公司（批號315-11C）、Lipofectamine2000轉染試劑購于美國Thermo Fisher公司（批號11668027）。

1.2 方法

1.2.1 gRNA設計和寡核苷酸鏈合成 利用MIT在線軟件設計針對小鼠MGP基因的gRNA，在靶序列正義鏈的5’端添加??CACCG，反義鏈的5’端添加AAAC，3’端添加C。

1.2.2 gRNA表達載體構建 使用BsmBI限制性內切酶線性化質粒LentiCRISPRv2，酶切體系為：BsmBI 1 μL，LentiCRISPRv2 5 μg，10×buffer 5 μL，補水至50 μL，55℃酶切過夜。1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切質粒進行分離，利用DNA純化試劑盒回收需要的片段。gRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，退火反應體系為：gRNA Up（100 μM）1 μL，gRNA Down（100 μM）1 μL，10×Buffer 1 μL，補水至 10 μL。95℃反應5 min后自然冷卻至室溫。將退火產物與線性化LentiCRISPRv2質粒連接，連接反應體系為：線性化LentiCRISPRv2質粒200 ng，稀釋10倍的退火產物2 μL，10×Buffer 1 μL，T4連接酶1 μL，補水至10 μL，16℃反應4 h。將連接產物轉化至感受態(tài)細胞，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆，搖菌，次日送公司測序鑒定。將含有正確序列的菌液保種，提取質粒備用。

1.2.3 包裝重組慢病毒 293-T細胞接種于6孔板中，次日當達到70%密度時，利用Lipofectamine2000轉染試劑，分別將800 ng LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1，2，3，ctrl與600 ng psPAX2質粒、200 ng VSVG質粒一同轉染入293-T細胞中。8 h后換新鮮培養(yǎng)基。再過24 h后收集病毒上清備用。

1.2.4 感染RAW264.7細胞及篩選穩(wěn)定細胞株RAW264.7細胞接種于6孔板中，次日當達到50%密度時，加入含有50%病毒、8 μg/mL聚凝胺（polybrene）的新鮮培養(yǎng)基進行感染。24 h后換含有1 μg/μL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進行篩選（感染成功的RAW264.7細胞具有嘌呤霉素抗性），3 d后收取細胞擴大培養(yǎng)。

1.2.5 實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（qPCR）檢測MGP基因敲除效率 提取細胞總RNA，取1 μg進行反轉錄，cDNA稀釋10倍后使用TaKaRa實時熒光定量試劑盒，進行qPCR，反應體系為：2×mix 10μL、正/反向引物（10 μM）0.5 μL、cDNA 模板 5 μL，補水至20 μL。反應程序為：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因為內參，2-△△CT法進行數(shù)據分析。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測MGP基因敲除效率 收集細胞，用RIPA細胞裂解液提取蛋白，BCA法進行蛋白定量。取20 μg蛋白進行凝膠電泳，轉膜后用脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶1 000）孵育1 h，隨后曝光分析灰度值。

1.2.7 qPCR檢測破骨細胞分化標志分子的表達情況 對不同細胞克隆用破骨細胞誘導液（含有30 ng/mL M-CSF、100 ng/mL RANKL的10%FBS α-MEM完全培養(yǎng)基）進行誘導分化培養(yǎng)，每2天換液1次，5 d后待細胞出現(xiàn)明顯的破骨細胞形態(tài)特征（多核、巨大），收集細胞，提取總RNA，具體操作見1.2.5所述，檢測破骨分化標志分子Itgb3、Acp5、Ctsk的mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據以xˉ±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質粒的構建與鑒定根據小鼠MGP基因序列，利用網站評分選擇3種gRNA，合成的序列如下。gRNA1：5′-CACCGTTGCCACGGCCAGCGCAGCC-3′，5′-AAACGGCTGCGCTGGCCGTGGCAAC-3′；gRNA2：5′-CACCGAAAGAGGTACTGGAACTCGA-3′，5′-AAACTCGAGTTCCAGTACCTCTTTC-3′；gRNA3：5′-CACCGGCTGTGTGAGCGCTACGCCA-3′，5′-AAACTGGCGTAGCGCTCACACAGCC-3′；對照序列：5′-CACCGCGCTTCCGCGGCCCGTTCAA-3′，5′-AAACTTGAACGGGCCGCGGAAGCGC-3′。將上述寡核苷酸退火后與LentiCRISPRv2質粒連接，構建成LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質粒，測序鑒定結果如圖1所示，表明重組質粒構建成功。

圖1 LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質粒測序鑒定結果

2.2 MGP基因敲除效果鑒定

2.2.1 MGP基因敲除效果qPCR鑒定 包裝重組慢病毒并感染RAW264.7細胞，篩選后得到穩(wěn)定MGP基因敲除細胞克隆，qPCR驗證敲除效率。如圖2所示，以ctrl組作為對照，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1細胞的MGP表達水平為對照細胞的（18±4）%，敲除了82%，其敲除效率最佳；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA2細胞的MGP表達水平為對照細胞的（36±10）%，敲除效率為64%；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA3細胞的MGP表達水平為對照細胞的（26±7）%，敲除效率為74%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 不同RAW264.7細胞克隆MGP的mRNA水平

2.2.2 MGP基因敲除效果蛋白質印跡法鑒定 利用蛋白質印跡法檢測MGP蛋白表達情況，驗證不同gRNA敲除效果。如圖3顯示，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，與對照細胞（ctrl）相比，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1、2、3細胞克隆的MGP蛋白水平均明顯降低，MGP基因表達被有效地人為干預。

圖3 不同RAW264.7細胞克隆MGP的蛋白水平

2.2.3 MGP基因敲除后對破骨細胞分化的影響對不同細胞克隆用含30 ng/mL M-CSF、100 ng/mL RANKL的10%FBS α-MEM培養(yǎng)基進行誘導分化，每2天換液1次，5 d后收集細胞，提取總RNA，反轉錄成cDNA，qPCR檢測破骨細胞分化標志分子Itgb3、Acp5、Ctsk的mRNA水平。結果如圖4所示，3種敲除MGP的不同細胞克隆經誘導分化后，與對照細胞（ctrl）［（1.10 ± 0.11）、（1.02 ±0.09）、（1.12± 0.04）］相比，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1細胞的破骨標志分子Itgb3、Acp5、Ctsk mRNA水平分別為（2.29±0.17）、（2.86±0.15）、（2.07±0.13），均顯著增加（P＜0.05）；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA2、LentiCRISPRv2-MGP-gRNA3細胞的破骨標志分子的mRNA水平也均顯著增高［（1.79±0.12）、（1.75±0.17）、（1.69±0.09）；（1.62±0.19）、（2.21±0.13）、（1.91±0.15），P＜0.05］。以上結果提示敲除MGP后破骨細胞分化加速，表明MGP抑制破骨細胞分化。

3 討論

CRISPR/Cas 9是一種在基因組水平上由RNA指導Cas 9蛋白選擇性編輯目的基因的方法。由于操作簡單、耗時少，應用日益廣泛［1-4］。在基因敲除、調控基因的表達水平、疾病的基因編輯治療等方面發(fā)揮重要作用。相較于其他基因編輯技術，CRISPR中Cas 9蛋白具有不需要形成二聚體來發(fā)揮作用，可通過構建多個gRNA實現(xiàn)多重編輯并同時沉默任意數(shù)量的單個基因等優(yōu)勢。

本實驗利用CRISPR/Cas 9技術，在gRNA介導下使含有核酸酶、解旋酶等生物活性的Cas 9酶對MGP基因外顯子特定的DNA序列進行特異性切割，通過非同源性末端接合或同源性重組，在細胞DNA修復作用下，達到敲除基因的目的［9-11］。本研究利用CRISPR/Cas 9技術將RAW264.7細胞中的MGP基因表達水平敲低82%，該穩(wěn)定RAW264.7細胞系可用于進一步研究MGP功能。

圖4 不同RAW264.7細胞克隆破骨分化標志分子的mRNA水平：A為Itgb3，B為Acp5，C為Ctsk

MGP廣泛存在于軟骨、骨髓、動脈壁等組織中，是一種由84個氨基酸組成的維生素K依賴蛋白，調節(jié)骨形成和軟組織鈣化［20］。在骨骼中MGP參與了骨鈣化調節(jié)［12］。有研究證實MGP是血管和軟骨組織鈣化的抑制劑，在血管鈣化病變中MGP調節(jié)成骨細胞和軟骨細胞的分化［17-18］。MGP可抑制核因子-κB（NF-κB）活性，可能通過抑制RANKL促進成骨細胞分泌骨保護素OPG，促進成骨細胞存活［19］。以上研究揭示了MGP在成骨細胞、軟骨細胞中的作用，而MGP是否參與了破骨細胞分化成熟尚未見報道。

本實驗通過CRISPR/Cas 9技術，建立了穩(wěn)定低表達MGP的RAW264.7細胞系，利用蛋白質印跡法、qPCR對其MGP表達情況進行鑒定。相比于對照組，MGP基因的表達均明顯降低。進一步對不同細胞克隆進行破骨誘導分化，并通過qPCR檢測其破骨標志分子表達量，結果顯示穩(wěn)定低表達MGP的細胞克隆，其破骨標志分子的表達水平增高，證實MGP可抑制破骨細胞分化。但MGP參與破骨細胞分化的機制還有待深入研究，我們推測，MGP作為一種胞外基質蛋白，可能通過結合某些蛋白抑制破骨細胞分化。這需要更多的實驗證據，將是我們近期工作的主要方向。