新RNA編輯技術(shù)CRISPR-Cas13

劉彥均,陳志勝

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528231

CRISPR-Cas系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated Cas system,CRISPR-Cas)是微生物體內(nèi)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。它能在crRNA指引下將Cas核酸酶與靶序列相結(jié)合并將其進(jìn)行剪切。當(dāng)病毒入侵時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞能夠?qū)⑼鈦?lái)遺傳物質(zhì)的片段捕捉并整合到細(xì)胞自身基因組中的CRISPR序列中。當(dāng)病毒再次入侵時(shí)，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄生成的CRISPR RNA(crRNA)能夠與Cas核酸酶相結(jié)合并將其引導(dǎo)到靶序列上發(fā)揮酶切活性，從而起到監(jiān)控病毒入侵的作用。當(dāng)這種外源核酸片段再度出現(xiàn)時(shí)，Cas核酸酶能夠切斷這些遺傳片段，從而為細(xì)菌細(xì)胞提供免疫保護(hù)作用。

CRISPR-Cas13系統(tǒng)是以Cas13酶作為Cas核酸酶的CRISPR子系統(tǒng)，僅靶向RNA而不靶向DNA。自2016年6月報(bào)道發(fā)現(xiàn)一種特殊的RNA切割蛋白[1]以來(lái)，CRISPR-Cas13系統(tǒng)就備受全球研究人員的關(guān)注和重視，這不僅是因?yàn)樗且环N只靶向RNA的新型CRISPR系統(tǒng)，更重要的是它的靶向效率較高以及酶切能力優(yōu)異。傳統(tǒng)的CRISPR基因編輯方法，如Cas9等，雖然對(duì)DNA有著很強(qiáng)的特異性，對(duì)靶位點(diǎn)有著很高的靶向精準(zhǔn)度，但對(duì)RNA的特異性卻比較低，而且會(huì)出現(xiàn)一定的脫靶效應(yīng)，甚至?xí)?duì)細(xì)胞基因組造成一定的損傷，還會(huì)開(kāi)啟真核細(xì)胞的p53途徑從而引發(fā)細(xì)胞凋亡，因此在應(yīng)用方面具有一定的安全隱患。CRISPR-Cas13系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)RNA從而改變目的基因的表達(dá)效果，避免了直接操作基因組而產(chǎn)生的損傷。因此它既具有傳統(tǒng)CRISPR基因編輯方法的大多數(shù)優(yōu)點(diǎn)，而且在時(shí)間上、空間上和效率上比其他傳統(tǒng)的RNA編輯方法(如：RNAi等)更加安全可控。

1 CRISPR-Cas13系統(tǒng)概況

1.1 CRISPR-Cas13系統(tǒng)在CRISPR分類系統(tǒng)中的地位

目前已知的5種CRISPR/Cas系統(tǒng)可以根據(jù)發(fā)揮作用的構(gòu)成核酸蛋白酶的亞基的特點(diǎn)分為兩大類：一類系統(tǒng)(Class 1)和二類系統(tǒng)(Class 2)。

一類系統(tǒng)的核酸蛋白酶是一種多酶復(fù)合物，又稱多酶體系，它又可以按照CRISPR核酸酶的種類分為一類I型系統(tǒng)(Class 1 type I system)和一類III型系統(tǒng)(Class 1 type III system)。I型系統(tǒng)依賴多種Cas蛋白集合形成的級(jí)聯(lián)復(fù)合物作為核酸酶發(fā)揮作用，作用于DNA。III型系統(tǒng)依賴Csm因子(Type III-A/D)或者Cmr因子(Type III-B/C)的非級(jí)聯(lián)復(fù)合物作為核酸酶發(fā)揮作用，其中Type III-A/B作用于RNA，Type III-C/D作用于DNA。

二類系統(tǒng)的核酸蛋白酶是一種依賴單一效應(yīng)因子發(fā)揮作用的核酸酶，它又可以按照CRISPR核酸酶的種類分為二類II型系統(tǒng)(Class 2 type II system)和二類V型系統(tǒng)(Class 2 type V system)以及二類VI型系統(tǒng)(Class 2 type VI system)。II型系統(tǒng)又稱為CRISPR/Cas9系統(tǒng)，依賴于單一效應(yīng)蛋白質(zhì)Cas9，含有RuvC和HNH兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，主要作用于DNA。V型系統(tǒng)利用含有單個(gè)RuvC結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子作為核酸蛋白酶，如Cpf1、C2c1和C2c3，主要作用于DNA。VI系統(tǒng)依賴于含有兩個(gè)HEPN(higher eukaryotes and prokaryites nucleotide-binding domains，HEPN)結(jié)構(gòu)域的單效應(yīng)子作為核酸蛋白酶，如Cas13a，又稱作C2c2(Type VI-A)以及Cas13b(Type VI-B)、Cas13d(Type VI-D)，其核酸酶由單一的肽鏈折疊而成，對(duì)RNA很敏感而對(duì)DNA不敏感[1]。

1.2 CRISPR-Cas13系統(tǒng)的組成元件

CRISPR-Cas系統(tǒng)主要由兩個(gè)元件組成：CRISPR RNA(crRNA)和CRISPR相關(guān)核酸酶(Cas1、Cas2和Cas13)。

1.2.1CRISPR RNA(crRNA)crRNA上存在著2個(gè)區(qū)域：一個(gè)是位于5′端的31個(gè)堿基對(duì)組成的重復(fù)區(qū)域(repeat region)，另一個(gè)是位于3′端的28個(gè)堿基對(duì)組成的引導(dǎo)區(qū)域(guide region)。重復(fù)區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1)是1個(gè)柄環(huán)結(jié)構(gòu)，主要包含1個(gè)由5個(gè)堿基配對(duì)而成的莖、1個(gè)8～9個(gè)堿基的環(huán)和1個(gè)在莖內(nèi)第14個(gè)堿基起的2 nt凸起以及柄環(huán)結(jié)構(gòu)兩邊5′端和3′端的鄰近基序[2]。

圖1 Cas13a的crRNA平面結(jié)構(gòu)示意圖[2]Fig.1 Schematic diagram of crRNA plane structure of Cas13a[2]

重復(fù)區(qū)域具有兩個(gè)重要的作用，一是由于在其5′端存在一個(gè)直接重復(fù)序列(direct repeat，DR)使其能在促進(jìn)Cas13介導(dǎo)的靶RNA的剪切作用下保護(hù)自身不被核酸酶剪切降解；二是在其5′端和3′端分別有一段4 nt和5 nt的序列，它們可以使crRNA錨定在Cas13的NTD和Helical-1結(jié)構(gòu)域上，在crRNA和Cas13緊密結(jié)合方面起到關(guān)鍵作用。引導(dǎo)區(qū)域的序列與靶RNA序列互補(bǔ)后可以形成1個(gè)28 bp的引導(dǎo)-靶RNA二聚體(guide-target RNA duplex)，形似A-DNA螺旋。在這個(gè)二聚體中，還存在著一個(gè)對(duì)錯(cuò)配十分敏感的種子區(qū)(seed region)，位于crRNA的中央，大約在第9～15位核苷酸之間，當(dāng)此處發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，Cas13不能剪切靶RNA，進(jìn)而直接影響到Cas13的打靶效率[1,3-5]。

1.2.2CRISPR相關(guān)核酸酶(Cas13)與其他CRISPR II類系統(tǒng)的相關(guān)核酸酶的結(jié)構(gòu)相一致，Cas13的整體結(jié)構(gòu)是雙葉的，N-末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)和Helical-1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成crRNA識(shí)別葉(REC lobe)，HEPN1、Helical-2、Helical-3和HEPN2結(jié)構(gòu)域形成核酸酶葉(NUC lobe)。

在NTD和Helical-1結(jié)構(gòu)域之間形成的帶正電荷的通道內(nèi)(圖2)，crRNA的5′端重復(fù)區(qū)域與REC葉結(jié)合，使得crRNA的引導(dǎo)區(qū)域序列被引導(dǎo)到NUC區(qū)內(nèi)形成的空腔中。NUC葉包括兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域NUC1和NUC2，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的作用是將crRNA的引導(dǎo)區(qū)域“夾心”從而形成一個(gè)平面，以便于對(duì)與之相結(jié)合的ssRNA的靶序列進(jìn)行酶切。NUC1葉包含HEPN1的N端部分(HEPN1-I)和大的α螺旋結(jié)構(gòu)域Helical-2。NUC2葉包括HEPN1的C末端部分(HEPN1-II)、Helical-3和HEPN2結(jié)構(gòu)域。其中，Cas13各亞型的酶切位點(diǎn)與NTD和Helical-3結(jié)構(gòu)域的位置差異有關(guān)[2]。

圖2 crRNA的5′端柄環(huán)結(jié)合在NTD和Helical-1結(jié)構(gòu)域形成的通道[3]Fig.2 The 5′ end handle ring of crRNA binds between the channels formed by the NTD and Helical-1 domains[3]

雖然Cas13缺乏與任何已知的DNA核酸酶同源的結(jié)構(gòu)域(如：RuvC結(jié)構(gòu)域等)，但是其所含有的兩個(gè)特殊的HEPN1和HEPN2結(jié)構(gòu)域，是其具有RNA酶切能力的重要原因。其中對(duì)靶RNA的剪切起主要作用的是一些高度保守的氨基酸殘基，分別為HEPN1結(jié)構(gòu)域中的第597位精氨酸(Arg597)、第602位組氨酸(His602)、HEPN2結(jié)構(gòu)域中的第1 278位精氨酸(Arg1278)和第1 283位的組氨酸(His1283)。酶切過(guò)程中，HEPN1和HEPN2結(jié)構(gòu)域的保守部分會(huì)在相鄰的位置形成一個(gè)“X”形的三維空間形狀，這種R-X4-6-H基序?qū)⑸鲜?個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基被定位到口袋表面，構(gòu)成復(fù)合的對(duì)稱的活性口袋，對(duì)RNA酶切發(fā)揮關(guān)鍵作用[6](圖3)。

另外，保守性相對(duì)較弱的天冬酰胺殘基，也起著十分必要的作用，它們分別是HEPN1結(jié)構(gòu)域中第598位的天冬酰胺(Asn598)以及HEPN2結(jié)構(gòu)域中第1 279位的天冬酰胺(Asn1279)。如果缺乏其中任何一個(gè)，都會(huì)導(dǎo)致Cas13的酶切活性喪失[6]。

1.3 CRISPR/Cas13系統(tǒng)的識(shí)別位點(diǎn)與識(shí)別機(jī)制

CRISPR/Cas13系統(tǒng)的靶向特異性除了由crRNA和靶RNA之間的堿基配對(duì)決定以外，還與一個(gè)位于ssRNA與crRNA相結(jié)合的部分鄰近位點(diǎn)以及Cas13-crRNA復(fù)合物酶切活性的激活反應(yīng)相關(guān)。這個(gè)位點(diǎn)通常在靶ssRNA的3′末端，稱為前導(dǎo)區(qū)序列側(cè)翼位點(diǎn)[1](protospacer flanking site，PFS)，其作用與Cas9系統(tǒng)中的PAM相類似。ssRNA在Cas13-crRNA復(fù)合物的活化反應(yīng)中起到重要作用，因?yàn)镃as13a-crRNA復(fù)合物的活化需要通過(guò)與糖-磷酸鹽骨架的相互作用，使crRNA上引導(dǎo)部分的間隔區(qū)序列進(jìn)入一個(gè)扭曲的U型彎，從而形成HEPN核酸酶激活構(gòu)象。

圖3 Cas13的酶切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)——R-X4-6-H基序[3]Fig.3 The structure of enzymatic site of Cas13-R-X4-6-H motif[3]

以LbaCas13a為例，由于在與crRNA結(jié)合的過(guò)程中它的HEPN1-I的α2被扭曲，使R-X4-6-H基序的其中一個(gè)活性位點(diǎn)(H605)被掩埋在HEPN2環(huán)下，偏離了假定的活性位點(diǎn)，使其無(wú)法形成一個(gè)“X”形的三維空間結(jié)構(gòu)，從而不具有催化活性。因此Cas13-crRNA復(fù)合物在與ssRNA結(jié)合之前保持無(wú)活性狀態(tài)。只有充當(dāng)激活劑的ssRNA與Cas13-crRNA結(jié)合后誘發(fā)協(xié)同構(gòu)象變化，才能激活Cas13-crRNA的酶切活性。而非配對(duì)ssRNA無(wú)法穩(wěn)定地與Cas13-crRNA復(fù)合物相結(jié)合，從而導(dǎo)致Cas13對(duì)靶RNA的高度靶向特異性[2,6]。

2 CRISPR-Cas13系統(tǒng)的分子作用機(jī)制

CRISPR-Cas13系統(tǒng)的分子作用主要分為四個(gè)階段(以C2c2為例，以下統(tǒng)一將C2c2稱為Cas13a)(圖4)。第一階段，pre-crRNA的識(shí)別與結(jié)合階段。新轉(zhuǎn)錄的pre-crRNA通過(guò)crRNA的5′端柄環(huán)結(jié)構(gòu)與Cas13a的REC葉識(shí)別并結(jié)合，形成pre-crRNA與Cas13a復(fù)合物的中間過(guò)渡態(tài)，并進(jìn)入第二階段，誘發(fā)NUC區(qū)的Helical-1和HEPN2結(jié)構(gòu)域之間保守殘基的構(gòu)象發(fā)生變化，從而形成一個(gè)酸堿催化中心，催化酶切pre-crRNA形成成熟的crRNA。此時(shí)形成穩(wěn)定態(tài)的crRNA-Cas13a復(fù)合物，處于無(wú)酶切活性的狀態(tài)。第三階段，酶切活性激活階段。靶ssRNA進(jìn)入crRNA-Cas13a復(fù)合物內(nèi)與crRNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，誘發(fā)Cas13a發(fā)生協(xié)同構(gòu)象變化，從而激活crRNA-Cas13a復(fù)合物的酶切活性。第四階段為酶切反應(yīng)。在crRNA的引導(dǎo)下，Cas13a的HEPN結(jié)構(gòu)域形成R-X4-6-H催化反應(yīng)中心，催化靶ssRNA的酶切。有時(shí)細(xì)菌細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)非特異性酶切的情況，導(dǎo)致細(xì)胞中其他附屬單鏈RNA(ssRNA)的降解[1,4]，引起一定的細(xì)胞毒性，但這種現(xiàn)象在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并未出現(xiàn)，其原因目前尚未可知。例如：在人細(xì)胞系中，僅僅靶向crRNA指定的RNA，細(xì)胞中所有其他的RNA保持完整。

圖4 CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的分子作用機(jī)制[4]Fig.4 Molecular interaction mechanism of CRISPR-Cas13a system[4]

3 其他種類的CRISPR-Cas13系統(tǒng)

CRISPR-Cas13系統(tǒng)除了VI-A亞型以外，目前研究得比較深入的還有VI-B和VI-D兩個(gè)亞型。它們雖然同屬于VI型系統(tǒng)，有著相似的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，但是又各有差異，以下將其分別與VI-A進(jìn)行對(duì)比以便更清楚的闡述。

3.1 CRISPR-Cas13b系統(tǒng)(VI-B亞型)

CRISPR-Cas13b系統(tǒng)有兩種酶，分別是VI-B1和VI-B2，它們之間的區(qū)別在于Cas13b轉(zhuǎn)座子上攜帶的附屬蛋白的基因型不同，VI-B1的附屬蛋白是Csx27而VI-B2的附屬蛋白是Csx28。VI-B型系統(tǒng)由3個(gè)元件組成(圖5)：crRNA、CRISPR相關(guān)核酸酶Cas13b、附屬蛋白Csx27/Csx28[7]。與VI-A亞型系統(tǒng)相比，VI-B亞型系統(tǒng)主要有四點(diǎn)比較明顯的差異：①VI-B亞型系統(tǒng)屬于CRISPR II類系統(tǒng)中唯一缺乏Cas1和Cas2的VI型系統(tǒng)；②Cas13b的酶活性受到其轉(zhuǎn)座子上所攜帶的附屬蛋白Csx27/Csx28的影響。Csx27的表達(dá)會(huì)抑制Cas13b上HEPN結(jié)構(gòu)域活躍的催化活力，而Csx28的表達(dá)則會(huì)增強(qiáng)Cas13b上HEPN結(jié)構(gòu)域活躍的催化活力；③Cas13b的crRNA根據(jù)直接重復(fù)序列的長(zhǎng)度存在長(zhǎng)短兩種不同的變體。Cas13b的成熟crRNA由30 nt的引導(dǎo)區(qū)域和36 nt的重復(fù)區(qū)域組成，一共66 nt。其中66 nt的為短直接重復(fù)序列crRNA，118 nt的為長(zhǎng)直接重復(fù)序列crRNA，形成的原因在于其36 nt的重復(fù)序列中有30～50個(gè)片段被中間重復(fù)序列打斷；④Cas13b靶向依賴分別在ssRNA與crRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合部分的5′和3′端的雙向PFS(double-side PFS)。其中5′端的PFS一般為D(A/U/G)，3′端的PFS一般為NAN或NNA。此外，Cas13b的酶活性要比Cas13a強(qiáng)，尤其是PspCas13b[8]。

圖5 VI-B系統(tǒng)示意圖[7]Fig.5 Schematic diagram of VI-B system[7]

3.2 CRISPR-Cas13d系統(tǒng)(VI-D亞型)

CRISPR-Cas13d系統(tǒng)又稱CasRX，由三部分組成：crRNA、CRISPR相關(guān)核酸酶(Cas1、Cas2和Cas13d)、附屬蛋白WYL1。與VI-A亞型系統(tǒng)相比，VI-D亞型系統(tǒng)主要有四點(diǎn)比較明顯的差異(圖6)：①CRISPR相關(guān)核酸酶Cas13d的分子量比Cas13a-c要小得多，一般在190～300個(gè)氨基酸左右。②Cas13d的附屬蛋白WYL1能正向誘導(dǎo)Cas13d的靶向和酶切活性。③Cas13d上有靶向需要的最小序列(minimal sequence)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)(H7H、RHH)。Cas13d靶向RNA的時(shí)候并不需要crRNA-ssRNA結(jié)合位點(diǎn)相鄰的基序或是位于間隔區(qū)的位點(diǎn)或者序列的協(xié)助。它是專門(mén)針對(duì)RNA的靶向因子，僅依靠Cas13d上的最小序列以及二級(jí)結(jié)構(gòu)靶向RNA。④Cas13d必須依賴二價(jià)陽(yáng)離子產(chǎn)生成熟的crRNA。這是因?yàn)樾〕叽绲腃as13d蛋白導(dǎo)致其缺乏部分像Cas13a中負(fù)責(zé)形成成熟crRNA的Helical結(jié)構(gòu)域片段，因此與Cas13a不同，Cas13d的成熟crRNA需要通過(guò)另一種途徑形成，即必需通過(guò)二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)輔助形成成熟的crRNA。

Cas13d效應(yīng)因子具有很強(qiáng)的靶向切割能力和RNase活性，并且相對(duì)較小的尺寸特別適合在體內(nèi)傳遞，在藥物研發(fā)和基因治療方面具有很大的應(yīng)用潛力[9]。

圖6 VI-D系統(tǒng)示意圖[9]Fig.6 Schematic diagram of VI-D system[9]

4 與其他RNA水平調(diào)節(jié)方法的比較

4.1 與RNAi的比較

RNA干擾(RNA interference,RNAi)依靠雙鏈RNA(double strands RNA，dsRNA)促使mRNA降解，誘使細(xì)胞產(chǎn)生特定基因缺失的表型。其中，dsRNA能在Dicer酶(Ⅲ型內(nèi)切酶)的作用下產(chǎn)生21～23 nt的siRNA，并與細(xì)胞內(nèi)特異性的核酸酶結(jié)合后形成沉默復(fù)合體(RNA-inducing silence complex,RISC)，這個(gè)RISC可以識(shí)別靶mRNA，并利用復(fù)合物中的RNase在靶mRNA與siRNA結(jié)合區(qū)域的中間將其切斷[10]。

4.1.1二者對(duì)細(xì)胞功能的影響 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，大于30 bp的dsRNA會(huì)引起干擾素效應(yīng)和非特異性基因抑制,導(dǎo)致mRNA非特異性降解[10]，而CRISPR/Cas13系統(tǒng)并不會(huì)引起非特異性基因抑制，這是因?yàn)镃as13酶并不是細(xì)胞原有的酶，而是通過(guò)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)的，所以并不會(huì)影響到其他基因的正常表達(dá)。其次Cas13系統(tǒng)也不會(huì)引起級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，因此也就不太容易擾亂細(xì)胞內(nèi)正常的表達(dá)體系，而且更可控。此外，CRISPR/Cas13也并非來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此，它不太可能擾亂細(xì)胞內(nèi)天然的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4.1.2二者在脫靶反應(yīng)方面的對(duì)比 RNAi的脫靶反應(yīng)包括：非特異性酶切和特異性位點(diǎn)脫靶。dsRNA在Dicer酶的作用下產(chǎn)生的正義鏈和反義鏈siRNA中，應(yīng)是反義鏈和RISC蛋白結(jié)合形成RISC效應(yīng)物后，由反義鏈siRNA介導(dǎo)靶向結(jié)合并酶切目的序列。由于正義鏈siRNA和反義鏈siRNA有著相同的與RISC蛋白結(jié)合形成效應(yīng)物的能力，所以由正義鏈siRNA介導(dǎo)的靶向會(huì)引起非特異性序列的酶切，從而造成非特異性的基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。反義鏈siRNA介導(dǎo)的特異性位點(diǎn)脫靶現(xiàn)象主要與siRNA-3′UTR配對(duì)的過(guò)程有聯(lián)系，但具體是如何聯(lián)系的目前尚未可知[11]。

CRISPR的脫靶反應(yīng)一般與靶序列和引導(dǎo)序列之間的識(shí)別作用相關(guān)[12]。以Cas9為例，與Cas酶結(jié)合后的引導(dǎo)序列會(huì)進(jìn)入PAM識(shí)別階段，只有在能識(shí)別的情況下才能啟動(dòng)R環(huán)(R-loop)，促使引導(dǎo)序列與靶序列之間發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)酶切反應(yīng)[12]。而Cas13除了依賴3′末端的PFS識(shí)別外，還需要位于引導(dǎo)序列中間能與靶序列發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)的種子區(qū)不發(fā)生錯(cuò)配才能介導(dǎo)Cas13酶的酶切反應(yīng)，這種雙重保險(xiǎn)的特點(diǎn)使得Cas13的精準(zhǔn)度比傳統(tǒng)的RNA編輯技術(shù)高。

此外，由于CRISPR的酶是外源性的，因此還可以對(duì)Cas酶作一些優(yōu)化性的設(shè)計(jì)和改造，增強(qiáng)Cas酶對(duì)靶序列的親和力，從而提高Cas酶的靶向能力，使酶切反應(yīng)更容易進(jìn)行，而內(nèi)源性的酶卻沒(méi)有這方面的特點(diǎn)。因此在可優(yōu)化空間與可控性方面，CRISPR的Cas酶要更勝一籌。

4.2 與Type III-A/B的比較

CRISPR系統(tǒng)中的III型A類和B類系統(tǒng)也具有介導(dǎo)ssRNA酶切的能力，這是由于其多酶系統(tǒng)中的Csm6酶或Csx1酶都含有一個(gè)位于C端的HEPN結(jié)構(gòu)域。其介導(dǎo)ssRNA酶切的反應(yīng)需要兩分子的Csm6酶或者Csx1酶參與。這是因?yàn)橹挥挟?dāng)兩分子的Csm6酶或Csx1酶二聚化后才能形成一個(gè)完整的復(fù)合對(duì)稱的活性口袋結(jié)構(gòu)，從而具有酶切RNA的能力[1,13-15]。這也就意味著在實(shí)際運(yùn)用的過(guò)程中，Cas酶需要達(dá)到一個(gè)較高的表達(dá)水平才能出現(xiàn)對(duì)ssRNA的酶切活性，而Cas13系統(tǒng)卻可以在低濃度條件下表現(xiàn)出特異性強(qiáng)的ssRNA酶切活性，靈敏度極高。

5 CRISPR-Cas13系統(tǒng)的應(yīng)用前景

5.1 疾病診斷

由于CRISPR-Cas13系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)靶向酶切特定的RNA序列后表現(xiàn)出非特異性——RNA酶活性，即附帶切割活性(collateral cleavage)。研究者們把Cas13酶改造成了一種快速、廉價(jià)且高靈敏度的診斷工具，并將其命名為“SHERLOCK”(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)(圖7)。它主要包括兩部分：Cas13酶以及一種被切割時(shí)會(huì)發(fā)出熒光的RNA報(bào)告分子。當(dāng)Cas13酶的非特異性RNA酶活性被靶RNA序列激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致這種RNA報(bào)告分子被酶切，從而釋放熒光信號(hào)。

為了使這項(xiàng)技術(shù)更方便，研究人員們還開(kāi)發(fā)出了一種快速的檢測(cè)方法，所使用的試劑能夠在室溫條件下運(yùn)輸和存儲(chǔ)，因此這種工具能夠在幾乎任何環(huán)境下使用。通過(guò)依賴體溫的擴(kuò)增就可增加樣品中的RNA濃度，從而將這種靶向RNA 的CRISPR工具的靈敏度增加了一百萬(wàn)倍。雖然目前僅開(kāi)發(fā)出了專門(mén)針對(duì)診斷寨卡病毒和Dengue病毒的檢測(cè)試紙(圖8)，但這項(xiàng)技術(shù)將來(lái)有望被用來(lái)應(yīng)對(duì)病毒性和細(xì)菌性流行病的爆發(fā)、抗生素耐藥性的監(jiān)控和癌癥檢測(cè)，因而具有引發(fā)全球公共衛(wèi)生變革研究的潛力[16]。

圖7 SHERLOCK技術(shù)原理示意圖[16]Fig.7 Schematic diagram of the principle of SHERLOCK technology[16]

圖8 檢測(cè)試紙的反應(yīng)原理示意圖[16]Fig.8 Schematic diagram of reaction principle of test paper[16]

5.2 單堿基突變技術(shù)(REPAIR)

為了將CRISPR-Cas13系統(tǒng)構(gòu)建成便捷的RNA編輯工具，研究人員設(shè)計(jì)出一款雙組分的RNA編輯器：Cas13酶經(jīng)突變后失去酶切活性，制成Cas13酶的突變體——dCas13，將這種突變體與RNA腺苷脫氫酶ADAR相融合，利用ADAR能夠?qū)⑾佘辙D(zhuǎn)化成鳥(niǎo)苷或肌苷的特點(diǎn)，可以在特定的位置引入點(diǎn)突變或是終止密碼子，從而改變RNA的功能?；谶@個(gè)原理，研究人員將dCas13b與ADAR的結(jié)構(gòu)域ADAR2DD(E488Q)相融合，制成第一個(gè)精確編輯RNA的CRISPR工具：REPAIRv1(RNA editing for programmable A to I (G)replacement Version 1.0)(圖9)。但是由于ADAR2DD的容量太大使其難以裝進(jìn)腺病毒載體且容易產(chǎn)生大量的脫靶反應(yīng)，研究人員將ADAR2DD進(jìn)行截短和改造，研發(fā)出了有著最高編輯效率以及最低脫靶效應(yīng)的突變體ADAR2DD(E488Q/T375G)，并將其與Cas13b相融合，制成的REPAIRv2系統(tǒng)，將REPAIRv1系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)的18 385個(gè)脫靶位點(diǎn)降低到僅出現(xiàn)20個(gè)脫靶位點(diǎn)[7]。

圖9 REPAIR示意圖[7]Fig.9 Schematic diagram of REPAIR[7]

REPAIR系統(tǒng)作為第一個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)精確RNA編輯的CRISPR系統(tǒng)，在RNA工程史上具有劃時(shí)代的里程碑意義。為了實(shí)現(xiàn)胞嘧啶的定點(diǎn)編輯，未來(lái)研究人員有望找到可以將dCas13與之相融合的胞苷脫氫酶，或者對(duì)ADAR進(jìn)行改造，以實(shí)現(xiàn)ADAR能接受胞嘧啶底物[7，17]。

5.3 疾病治療

由于CRISPR-Cas13d系統(tǒng)指導(dǎo)的RNA編輯具有不需要同源指導(dǎo)修復(fù)機(jī)制(HDR)、不需要PFS識(shí)別位點(diǎn)、尺寸小、不含具有酶切DNA活性的RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域等特點(diǎn)，相對(duì)于CRISPR其他系統(tǒng)更適合用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞方面的疾病治療。不需要HDR，更適合用于不分裂的細(xì)胞；不需要PFS識(shí)別位點(diǎn)，比CRISPR其他系統(tǒng)更靈活；不包含RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域，不能直接編輯基因組，在安全性上更好；尺寸小，更適合在體內(nèi)傳遞；缺乏crRNA的成熟反應(yīng)相關(guān)的結(jié)構(gòu)域但是具有靶向RNA需要的最小序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此特別適合在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行RNA編輯。根據(jù)CRISPR-Cas13d系統(tǒng)的這些特點(diǎn)，未來(lái)可以研發(fā)基于CRISPR-Cas13d系統(tǒng)的多種疾病的治療方法，即通過(guò)Cas13d定向降解RNA從而降低致病基因的表達(dá)水平來(lái)矯正細(xì)胞中的蛋白水平，從而實(shí)現(xiàn)疾病的治療?；谶@個(gè)原理，研究人員于2019年3月就成功地利用Cas13d來(lái)校正癡呆癥患者細(xì)胞中蛋白的不平衡表達(dá)，使其恢復(fù)到正常的蛋白表達(dá)水平[18]。雖然這種方法目前還停留在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，但在研究人員的不斷努力下，未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)疾病的精準(zhǔn)靶向治療。

6 展望

雖然基于CRISPR-Cas13的RNA編輯技術(shù)Cas13伴隨有較強(qiáng)的附屬非特異性酶切特性，但其準(zhǔn)確性極高的特異性酶切能力仍不可忽視。在研究上，Cas13針對(duì)靶RNA極強(qiáng)的特異性將會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究帶來(lái)更加精確可靠的研究工具；在檢測(cè)與疾病預(yù)防上，利用Cas13的附屬酶切活性將會(huì)給檢測(cè)人員以及檢疫人員提供更可靠便捷迅速的檢測(cè)工具，在治療上，對(duì)于需要基因表達(dá)短期變化的疾病來(lái)說(shuō)，基于CRISPR-Cas13的RNA編輯可能更有效。未來(lái)，CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)的下一個(gè)目標(biāo)將會(huì)向RNA編輯方向邁進(jìn)?；贑RISPR-Cas13的RNA編輯技術(shù)或許能給轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究以及疾病的預(yù)防與治療的研究注入極為強(qiáng)勁的動(dòng)力源泉，成為新時(shí)代不可或缺的RNA編輯的研究手段。未來(lái)，CRISPR-Cas13將會(huì)作為一項(xiàng)重要的RNA編輯技術(shù)手段，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域登臺(tái)亮相。