氣體生物傳感器的應用研究進展

粟元,李舒婷,許文濤,2*

1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100083；2.中國農業(yè)大學,農業(yè)農村部轉基因生物食用安全重點實驗室(北京),北京 100083

生物傳感器種類多樣，是基于物理、化學、生物的高新技術，在各行各業(yè)中被廣泛應用。生物傳感器具有許多優(yōu)點，如對多種靶標選擇性好、靈敏度高、檢測時間短等。近年來，氣體生物傳感器漸漸走進人們視野，它是一類輸出信號為氣體的生物傳感器，主要利用酶實現(xiàn)氣體信號的轉化，其設計方式多樣，輸出方式簡單，檢測速度快，氣體從無到有，從而使得背景值較低。

目前，氣體生物傳感器多是將識別信號轉化為顏色從而實現(xiàn)對各種靶物質如microRNA、癌細胞、端粒酶等的檢測，氣體信號表征方式較單一，且應用范圍有一定限制。粟元等[1]在前文中綜述了氣體生物傳感器識別機制的相關研究進展。本文將從氣體信號輸出的角度出發(fā)，介紹不同氣體生物傳感器的優(yōu)缺點，這有利于搭建不同種類的氣體生物傳感器；然后分類闡述蛋白酶介導的氣體生物傳感器、核酸酶介導的氣體生物傳感器、模擬酶介導的氣體生物傳感器和其他氣體生物傳感器的原理和應用，這有利于總結除顏色以外的信號表征輸出方式，如氣體濃度、氣壓和pH；最后，對氣體生物傳感器的檢測手段和應用前景提出了展望。

1 氣體生物傳感器

表1 多種氣體生物傳感器的對比Table 1 Comparison of different type of gas biosensors

2 氣體生物傳感器的應用

目前，氣體生物傳感器的應用主要集中在利用蛋白酶、核酸酶、模擬酶，以實現(xiàn)對細菌、miRNA生物標志物、毒素、塑化劑等靶物質的檢測，利用生物細胞和生化反應搭建體系的研究較少。

2.1 蛋白酶介導的氣體生物傳感器

2.1.1脲酶(urease)脲酶是由植物、真菌和細菌產生的一種含鎳酶，它催化尿素水解成氨和氨基甲酸酯。脲酶在生物化學中具有重要的歷史意義，它是第一個被結晶的酶。目前，有研究利用脲酶水解尿素產生氨氣，使溶液pH變化，建立pH與靶物質的濃度間的關系從而實現(xiàn)對靶物質的檢測，該傳感器應用于實際樣品的檢測，結果令人滿意。如Chen等[2]在黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)抗原上標記脲酶，靶標與脲酶標記的AFB1抗原競爭，被抗體捕獲。脲酶可催化尿素水解生成氨，誘導溶液pH升高，使用手持式pH計或pH敏感染料可以輕松檢測到變化。在優(yōu)化條件下，pH的增強與AFB1濃度的對數(shù)在0.62～23.42之間呈線性關系。圖1顯示了基于競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗的AFB1生物傳感器的工作原理。另外，也有研究利用氨分子與銀離子間的作用使體系顏色發(fā)生變化，建立顏色與靶物質的濃度間的關系從而實現(xiàn)對靶物質的檢測，該傳感器檢測限較低。Pei等[3]設計了用標記脲酶的OTA作為競爭抗原將尿素水解成氨，在氨分子存在下，銀離子被葡萄糖中的甲?；€原，在金納米花(33 nm，AuNFs)表面生成銀殼，溶液的顏色由藍色變?yōu)樽丶t色。

2.1.2辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)1976年，Welinder等[4]首次確定了HRP-C是一組單亞基糖蛋白，是一種以亞鐵血紅素為氧化還原中心的過氧化物酶，之后其被廣泛地應用在廢水處理、食品工業(yè)、有機合成和分析檢測等領域。目前，研究主要利用HRP催化體系產生的氣體與3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)之間的作用產生顏色變化這一原理設計傳感器檢測靶物質。如Wang等[5]將HRP與羧基官能化碳納米管共價偶聯(lián)，體系中的H2O2可進一步氧化TMB底物，得到比色產物。Zhu等[6]設計了基于HRP的用于檢測痕量鄰苯二甲酸二丁酯(din-butyl phthalate，DBP)的比色免疫傳感器，利用Cu(II)還原為Cu(I)，從而抑制HRP催化無色TMB氧化成藍色TMB。

2.1.3過氧化氫酶(catalase,CAT)目前，研究主要利用過氧化氫酶能夠與底物過氧化氫作用產生氣體這一原理開發(fā)生物傳感器，也有研究將過氧化氫酶制備成膜與其他物質結合增強催化性能。如Seetharamaiah等[7]提出了一種利用金屬離子配位組裝技術在石墨電極上制備的一維金納米結構和CAT多層膜的電化學生物傳感器。Mohd[8]研究了基于過氧化氫酶標記抗體的常規(guī)ELISA程序，即酶消耗過氧化氫，并通過添加金(III)氯化物進一步產生金納米粒子，溶液中殘留的過氧化氫的量決定了金納米粒子溶液是呈現(xiàn)藍色還是呈現(xiàn)紅色。

圖1 基于競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗的AFB1生物傳感器的工作原理[2]Fig.1 Working principle of AFB1 biosensor based on competitive enzyme-linked immunosorbent test[2]

2.2 核酸酶介導的氣體生物傳感器

G-四鏈體(G-quadruplexes)是一種特殊的DNA結構，是由富G核酸序列中4個鳥嘌呤(guanine,G)兩兩間形成2個霍氏氫鍵圍成的正方片層堆疊而成[9]。氯高鐵血紅素(hemin)作為相互作用劑，通過直接堆積或嵌入G-四鏈體形成氯化血紅素/G-四鏈體(hGQ)而與分子內G-四鏈體結構相互作用[10]。

目前，許多研究利用氯化血紅素/G-四鏈體作為新型催化劑，催化過氧化氫產生氧氣，并與TMB、ABTS等物質結合，使體系顏色發(fā)生變化，從而開發(fā)了各種生物傳感器。Zhang等[11]采用等溫比色法擴增檢測轉基因生物中的CaMV 35S啟動子序列。在體系中，G-四鏈體與Hemin形成具有過氧化物酶活性的DNA酶，催化H2O2介導的生色酶底物2,2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽離子[2,2′-diazo-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt ion，ABTS2-]的氧化導致綠色產物的形成。

2.3 模擬酶介導的氣體生物傳感器

2.3.1納米酶 各種納米材料，如貴金屬納米顆粒、碳基納米顆粒、金屬氧化物納米顆粒、金屬硫化物納米顆粒、復合納米顆粒，已經發(fā)現(xiàn)具有擬過氧化物酶活性，研究集中在通過納米酶催化底物TMB、ABTS產生有色物質實現(xiàn)可視化檢測或檢測體系氣體壓力，由此設計不同氣體生物傳感器實現(xiàn)對不同靶物質的定量檢測。

納米酶分為基于非金屬納米材料的納米酶和基于金屬納米材料的納米酶。基于非金屬納米材料的納米酶常見的如碳納米材料。Hayat等[12]提出了具有類過氧化物酶活性的在碳納米管(carbon nano tube,CNT)表面上摻入氧化鋅納米顆粒(ZnO)的納米復合材料。

全國政協(xié)常委、副秘書長、新教育發(fā)起人朱永新在主旨演講中指出，公私合作、民辦學校的分類管理及小微學校的合法化是當前體制改革的熱點；國家教育發(fā)展研究中心教育體制改革研究室主任王烽對當前深化辦學體制改革的幾個關鍵問題進行了解讀；北京師范大學教授曾曉東和臺灣振鐸學會理事長丁志仁分別就美國的“擇校”現(xiàn)象及臺灣實驗教育的立法與實踐等話題與參會者進行了深入探討。

基于金屬納米材料的納米酶包括金納米粒子、鉑納米粒子、銅納米粒子和Fe3O4磁納米粒子。金納米粒子(AuNPs)的過氧化物酶樣活性遵循Michaelis-Menten動力學模型，并且依賴于環(huán)境pH和溫度，這與HRP非常相似。與HRP不同的是AuNPs的活性非常高，即使H2O2濃度比HRP低兩個數(shù)量級，AuNPs只需要較低H2O2濃度在很窄范圍內也能達到最大反應速率并避免酶中毒[13]。Ding等[14]制備了三元金屬雜化納米粒子(FePt-Au HNPs)，其具有優(yōu)異的過氧化物酶活性。Shi等[15]用磁珠(MB)和鉑納米顆粒(PtNPs)催化H2O2產生大量的O2，通過檢測氣體壓力值測定靶標。這比之前的許多報告更敏感。Liu等[16]通過將目標響應水凝膠與壓力計讀數(shù)相結合，當靶物質存在時，刺激水凝膠反應允許釋放預載的PtNPs，將H2O2分解為O2。然后，在密封環(huán)境中產生的O2導致顯著的壓力增加，這可以通過手持式壓力計容易地讀出。使用這種基于目標的水凝膠壓力測定，可以實現(xiàn)便攜式和高靈敏度的可卡因、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)和鉛離子檢測，具有出色的準確度和選擇性，圖2顯示了其原理。Borghei等[17]開發(fā)了一種基于DNA模板化銅納米團簇(DNA-CuNCs)的過氧化物酶，通過它可以構建簡便、廉價、快速的比色法。Chen等[18]制備了具有類過氧化物酶作用的Fe3O4納米纖維，并建立了檢測L-半胱氨酸的敏感平臺，對L-半胱氨酸的選擇性優(yōu)于其他氨基酸、葡萄糖和金屬離子。

關于這幾種材料所結合的方法、原理和檢測限的比較如表2所示，雖然檢測的靶標不一致，但所構建的原理可以參考，并根據(jù)該方法可以結合當前各材料的應用優(yōu)勢進行優(yōu)化并超越。

表2 不同納米材料模擬酶的比較Table 2 Comparison of different nanomaterials mimic enzymes

2.3.2金屬有機骨架(metal-organic frameworks，MOFs)金屬有機骨架是一類由金屬離子或簇與有機連接基團在相對溫和的條件下自組裝形成的混合材料[19]。MOFs 屬于一種新興的結晶分子功能材料，具有很多特性，其中包括：超高的孔隙率、優(yōu)異的結構可調性、巨大的內部表面積、結構多樣性、高的化學穩(wěn)定性和強大的熱穩(wěn)定性等[20-21]，同時還具有催化活性[22]。

目前，主要利用MOFs的類過氧化物酶活性與底物過氧化氫作用設計開發(fā)氣體生物傳感器。Qi等[23]設計并制造了一種能夠為過氧化氫的催化反應發(fā)出熒光的PA-Tb-Cu MOF納米酶。Li等[24]合成了柱狀多金屬氧酸鹽金屬有機骨架[Cu5(pz)6Cl][SiW12O40] (CuSiW12)。值得注意的是其類過氧化物酶活性優(yōu)于原硅鎢酸，且體系具有靈敏度高、線性范圍寬、檢測下限低、對H2O2的響應時間快(2 min)等特點。

2.3.3小分子物質 熒光素是一類小分子物質，因其多功能的熒光特性，在醫(yī)學、生物成像和生物傳感等領域得到了廣泛的應用。熒光素介導的氣體生物傳感器的應用主要集中在利用它們的擬過氧化物酶性能，其功能與天然氧化酶相同。與HRP相比，熒光素對TMB表現(xiàn)出更高的親和力，主要通過與顯色底物如TMB、鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)和ABTS作用發(fā)生顏色變化實現(xiàn)對靶物質的檢測。Li等[25]研究了2′,7′-二氟熒光素(2′,7′-difluorofluorescein，DFF)的過氧化物酶樣活性，其可以催化H2O2氧化TMB以產生藍色氧化產物。值得注意的是，DFF顯示出比熒光素和2′,7′-二氯熒光素(2′,7′-dichlorofluorescein，DCF)更高的過氧化物酶樣活性。

2.4 生物細胞介導的氣體生物傳感器

目前，利用生物細胞構建酶基因表達催化底物產生氣體的生物傳感器很少，具有催化活性的生物細胞較多。Liu等[26]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌脲酶(BpUrease)是一種有前景的生物催化劑。由此可設計用特定變體有效降解模型黃酒中的尿素和乳油產生氣體。Ripolles[27]研究開發(fā)了過氧化物生物檢測器，評估了一系列過氧化氫酶陽性細菌：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、腸沙門氏菌。形成生物膜的所有過氧化氫酶陽性食源性病原體均在生物檢測器的檢測中顯示陽性，檢測到的最小微生物負荷為104CFU/cm2，最強烈的陽性反應是銅綠假單胞菌。利用生物細胞表達基因或直接催化底物產生氣體，設計開發(fā)氣體生物傳感器用于檢測靶物質具有廣闊前景。

2.5 生化反應介導的氣體生物傳感器

對于生物體，體內體外都存在許多產生氣體的生化反應，例如三羧酸循環(huán)產氧和二氧化碳，水果、酒、泡菜、面團發(fā)酵產生香味，垃圾貯存產生氨氣、硫化氫等。在一定情況下，可根據(jù)產氣情況對食品質量進行分析控制。然而，目前利用生化反應構建的生物傳感器比較罕見。

通過將靶物質與催化產生氣體的物質相連接，構建氣體生物傳感器，隨著反應的進行，反應速率升高或降低存在動態(tài)變化，能夠構建相關性關系，進而實現(xiàn)對靶物質的檢測，且不需使用高效液相色譜儀等大型儀器來檢測氣體信號。

圖2 靶向響應水凝膠壓力法的工作原理[16]Fig.2 Working principle of target response hydrogel pressure method[16]

3 展望

本文結合生物技術和化學技術，介紹了通過酶搭建的氣體生物傳感器，分類綜述了氣體生物傳感器的應用，總結了當下利用氣體生物傳感器方法的檢測現(xiàn)狀，目前氣體生物傳感器在功能核酸檢測領域的應用還較少且比較單一，而關于結合生物技術和氣體濃度分析檢測靶物質的研究還未見報道，這種新的信號策略將為簡單、便攜、高靈敏度分析檢測靶物質開辟一條新途徑。

近年來，食品安全問題層出不窮，食品檢測技術仍舊面臨著巨大的挑戰(zhàn)，每年都會有新產品進入市場，因此對食品的檢測和安全性評價至關重要，基于氣體生物傳感器的檢測方法在多方面都有很廣闊的發(fā)展前景。

3.1 檢測設備的智能化、穩(wěn)定化

氣體濃度和壓力的測量沒有光學或磁場噪聲，氣體濃度儀和氣壓計對氣體敏感，檢測速度快，未來可以設計能與手機相連接的檢測設備，通過手機就能夠智能控制、監(jiān)測和分析；氣體容易散失，有些氣體易溶于水，可以根據(jù)氣體的不同性質設計氣體發(fā)生裝置收集氣體，使檢測結果能夠更加穩(wěn)定、準確、可靠。

3.2 模擬酶種類增加

近年來，人工模擬酶成本低廉、穩(wěn)定性高、催化活性高、易于儲存，且能有效降低干擾物的影響，未來可以設計更多方式方法開發(fā)制備種類多樣、高效催化的人工酶，還可以將納米材料、金屬有機骨架等性能優(yōu)良的不同材料復合使用，對比篩選出高效模擬酶使其應用更加廣泛。

3.3 檢測方法的通用性、均向性

利用酶催化底物取代傳統(tǒng)的化學催化或物理反應，反應過程副產物較少，且簡化了工藝、節(jié)省了設備、降低了危險且減少了污染等，反應體系的信號識別、信號轉化、信號輸出的一體化形成了循環(huán)放大，能夠實現(xiàn)對更多靶物質的均向檢測，未來可以增加氣體生物傳感器的通用性。

3.4 檢測領域的擴大以及多重檢測

總體而言，基于上述原理可開發(fā)制備大量更高效、更多元、更完善的氣體生物傳感器，同時檢測對象可進一步擴大，如應用于轉基因、重金屬、違法添加物質、生物標志物、生物毒素、病原微生物等靶標物質的檢測，未來氣體生物傳感器的利用潛力非常大，且檢測領域極為廣泛。

另外，氣體生物傳感器具有識別單一或復雜成分氣味的能力，當一種靶物質對應一種氣體時可以實現(xiàn)精準定量檢測；當反應體系產生幾種氣體時，可以同時檢測多種靶物質，或者將氣體信號分子與熒光信號分子、電化學信號分子等結合，實現(xiàn)對多重靶標物質的檢測，這對食品安全和核酸檢測研究具有重大的意義。