低壓低氧大鼠脫適應(yīng)期血腦屏障通透性和腦微血管密度的變化

羅 強(qiáng),劉衛(wèi)平,龍乾發(fā),張胡金,柴 源,苗 宇,伊西才

(1西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710003;2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:Liuwp@fmmu.edu.cn)

高原脫適應(yīng)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,也無(wú)有效的防治措施。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是人體對(duì)低氧刺激最敏感、耐受性最差的部位,高原低氧對(duì)其影響不言而喻。Fischer等[1]研究證實(shí),缺氧可損傷血腦屏障(blood brain barrier,BBB),引起腦血管通透性增高,使細(xì)胞間的異常漏出增多而發(fā)生水腫。組織缺氧會(huì)刺激CD34+細(xì)胞代償性增加并分化為內(nèi)皮細(xì)胞而形成新生血管[2]。因此,腦微血管密度(microvessel density,MVD)的代償性增加及BBB通透性增高與高原病的發(fā)生關(guān)系密切。而在脫離高原環(huán)境進(jìn)入常氧環(huán)境后,腦MVD及BBB通透性會(huì)發(fā)生怎樣的變化?本研究通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)性低壓低氧大鼠模型,探討在脫適應(yīng)期腦MVD和BBB通透性的改變及與返回常氧環(huán)境時(shí)間的關(guān)系,旨在為高原脫適應(yīng)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制及防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5-6周齡雄性SD大鼠72只,清潔級(jí),由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(軍)2007-007,體質(zhì)量150～200 g,隨機(jī)分為低壓低氧大鼠模型組與常氧環(huán)境對(duì)照組,根據(jù)返回常氧環(huán)境不同時(shí)間模型組又分為5個(gè)亞組,每組12只大鼠。

1.2 主要試劑和設(shè)備

伊文氏藍(lán)(Evans blue,EB)及甲酰胺均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,單克隆兔抗大鼠CD34抗體(BA0532)購(gòu)自于武漢博士德生物有限公司,免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑購(gòu)自北京中杉金橋公司。高原環(huán)境模擬艙為貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司,紫外分光光度儀為德國(guó)Sartotius公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物模型制備

模型組大鼠放入模擬海拔4 000 m的高原環(huán)境模擬艙,氧濃度為12.6%,溫度25 ℃,光照周期12 h,自由飲食水,定時(shí)向高原環(huán)境模擬艙內(nèi)添加水、鼠糧、更換墊料。在高原環(huán)境模擬倉(cāng)飼養(yǎng)4周后將其移至常氧環(huán)境,分別在至常氧環(huán)境后1,3,7,14,30 d,分別檢測(cè)每個(gè)亞組腦組織BBB通透性及CD34表達(dá)量。

1.4 伊文氏藍(lán)(EB)示蹤法測(cè)定血腦屏障通透性

伊文氏藍(lán)(EB)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:按照倍率稀釋法建立EB的標(biāo)準(zhǔn)曲線,配置質(zhì)量濃度10 mg/100 ml的原始EB溶液,以甲酰胺作為空白對(duì)照調(diào)零液,依次稀釋形成質(zhì)量濃度為10,5,2.5,1.25,0.625,0.312 5,0.156 3 μg/ml濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,60 ℃水浴孵育24 h，測(cè)定波長(zhǎng)625 nm處EB的吸光度(OD)值，繪制EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

腦組織EB含量的測(cè)定:使用EB作為檢測(cè)BBB通透性的示蹤劑,對(duì)照組及每個(gè)亞組內(nèi)隨機(jī)取6只大鼠,尾靜脈注入2% EB(2 ml/kg)。在注入EB幾分鐘后,可見(jiàn)大鼠眼球結(jié)膜、唇、四肢等顯示深藍(lán)色,表示EB注射進(jìn)入體循環(huán)。2 h后用250 ml預(yù)冷肝素生理鹽水灌注心臟,直至流出液顏色清亮,迅速取大鼠腦組織,稱重后機(jī)械性粉碎濕腦組織,按每100 mg濕腦組織加3 ml甲酰胺加蓋避光,60 ℃水浴24 h，3 000 r/min離心20 min，檢測(cè)樣本上清液的OD625 nm值，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出各樣本中EB的濃度，求得腦組織EB的含量(μg/g濕腦組織)。

1.5 免疫組化法檢測(cè)CD34的表達(dá)

到達(dá)取材時(shí)間后取每組剩余6只大鼠,10%水合氯醛麻醉后行左心室插管,依次用預(yù)冷肝素生理鹽水、4%的多聚甲醛灌注后取腦,所有腦組織立即放入10%多聚甲醛溶液固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,2 μm厚連續(xù)切片。免疫組化采用SP(streptavidin perosidase)法,切片常規(guī)梯度脫蠟至水,檸檬酸溶液中高溫高壓抗原修復(fù)100 s,3%H2O2溶液封閉20 min。山羊血清封閉1 h,滴加一抗,4 ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗,分別滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗,室溫孵育30 min,滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,室溫孵育20 min,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封片,陰性對(duì)照用PBS代替一抗。光學(xué)顯微鏡下,血管內(nèi)皮細(xì)胞核膜棕褐色為CD34+細(xì)胞,每組選10張切片,每張切片高倍鏡下(×400)在皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)取不重疊的5-10個(gè)視野進(jìn)行CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù),染成棕褐色的有核細(xì)胞均視為陽(yáng)性細(xì)胞,最后取高倍視野微血管數(shù)的平均值作為該組腦MVD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

低壓低氧模型組大鼠腦組織EB含量較對(duì)照組明顯增加,以返回常氧環(huán)境第1天最為顯著(P<0.01),在脫離低壓低氧環(huán)境后,腦組織EB含量隨著返回常氧環(huán)境時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸呈降低的趨勢(shì),與返回時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.898,P=0.038),而模型組大鼠在返回常氧環(huán)境30 d時(shí)腦組織EB含量仍然高于對(duì)照組水平(P<0.05,見(jiàn)圖1,2),表明BBB通透性尚未完全恢復(fù)到正常水平。與BBB通透性的變化一致,低壓低氧模型組大鼠腦MVD(CD34+細(xì)胞數(shù))與對(duì)照組相比明顯增多(P<0.01),在脫離低氧環(huán)境早期時(shí)最為明顯,腦MVD的變化與返回常氧環(huán)境時(shí)間呈高度負(fù)相關(guān)(r=-0.883,P=0.016);模型組在返回常氧環(huán)境30 d時(shí)也高于對(duì)照組水平(P<0.05，見(jiàn)圖1,2),表明腦MVD的改變?nèi)蕴幵诿撨m應(yīng)期。

圖1 低壓低氧模型組大鼠返回常氧環(huán)境后CD34+細(xì)胞的表達(dá)變化 (×400)

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

脫適應(yīng)癥是人體脫離高原低氧進(jìn)入常氧環(huán)境后的一種適應(yīng)性反應(yīng),會(huì)伴隨一系列的生理反應(yīng)和臨床表現(xiàn),其主要癥狀有疲倦、乏力、嗜睡、胸悶、氣短、頭昏、腹脹、腹瀉等[3-7]。近年來(lái),高原地區(qū)與平原地區(qū)交流更加廣泛,加之參加青海玉樹(shù)等高原地區(qū)抗震救災(zāi)官兵返回平原后出現(xiàn)的脫適應(yīng)反應(yīng),使得高原脫適應(yīng)反應(yīng)越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[8]。

BBB是中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血循環(huán)之間物質(zhì)交換的調(diào)節(jié)器,由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成的,對(duì)于維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定起到關(guān)鍵的作用,其通透性的改變是多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中常見(jiàn)的、較早發(fā)生的變化[9,10]。有研究顯示,高原低氧暴露對(duì)BBB及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷使其通透性增高,血管內(nèi)滲出增多,腦組織含水量增加,表明高原腦水腫是一種血管源性水腫[11,12]。腦微血管是供給腦組織氧、營(yíng)養(yǎng)必需物質(zhì)及相應(yīng)量血液的傳送裝置,已有研究表明機(jī)體在受到低氧、缺血、損傷等刺激時(shí),作為一種保護(hù)性因素的腦MVD會(huì)代償性增加,而CD34+細(xì)胞在過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,CD34+細(xì)胞是一類具有自我更新,多向分化及重建造血和免疫的內(nèi)皮祖細(xì)胞,在促進(jìn)血管新生、組織修復(fù)、創(chuàng)傷愈合等方面發(fā)揮著重要的作用[13]。在機(jī)體受到低氧、損傷等刺激時(shí),CD34+細(xì)胞會(huì)代償性增加。Gong等[14]報(bào)道,在CD34+細(xì)胞聚集的過(guò)程會(huì)伴隨著血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管生成素等促血管生成因子的分泌增加,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9的活化,抑制緊密連接蛋白的表達(dá),從而增加BBB的通透性,加重腦水腫。由此可見(jiàn)在機(jī)體受到低氧、損傷等刺激時(shí)CD34+細(xì)胞的增多與BBB通透性及腦水腫密切相關(guān)[15]。

本次研究結(jié)果顯示,低壓低氧大鼠在重返平原后BBB通透性及腦MVD較對(duì)照組明顯增加,隨著返回時(shí)間的延長(zhǎng)均呈降低的變化趨勢(shì)。石自福等[8]曾報(bào)道,脫適應(yīng)反應(yīng)癥狀多出現(xiàn)返回平原后1周,大多癥狀在一個(gè)月內(nèi)逐漸減退并消失,但有些持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)甚至反復(fù)出現(xiàn)。Pichiule等[16]發(fā)現(xiàn)大鼠從高海拔缺氧環(huán)境返回常氧環(huán)境后短時(shí)間內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量及腦MVD依然較高,保持了較強(qiáng)的輸氧能力,使組織處于高氧狀態(tài),在返回常氧環(huán)境后,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加以降低大腦MVD。本研究結(jié)果證實(shí),BBB通透性及腦MVD的改變以返回常氧環(huán)境早期時(shí)最為顯著,與高原脫適應(yīng)反應(yīng)發(fā)生有時(shí)間上的一致性。因此,高原脫適應(yīng)反應(yīng)的發(fā)生可能與低壓低氧引起的BBB通透性及腦MVD的改變有關(guān)。BBB通透性增加,屏障功能減弱,可促使腦水腫的形成,也可使一些代謝有害物質(zhì)大量進(jìn)入腦組織,破壞了神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定;腦MVD的增加使得腦組織處于一種相對(duì)高氧的狀態(tài),出現(xiàn)“醉氧”的一些癥狀。在返回常氧環(huán)境30 d時(shí),BBB通透性及腦MVD仍然高于對(duì)照組,表明高原脫適應(yīng)是一個(gè)相對(duì)漫長(zhǎng)的過(guò)程,要完全脫適應(yīng)需要更長(zhǎng)的時(shí)間。

本次研究從神經(jīng)系統(tǒng)BBB通透性及腦MVD在脫適應(yīng)期的改變進(jìn)行分析,為預(yù)防和治療脫高原適應(yīng)反應(yīng)及藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。然而,高原脫適應(yīng)反應(yīng)是神經(jīng)、血液、循環(huán)、呼吸、內(nèi)分泌等多個(gè)系統(tǒng)共同參與的全身性疾病,要完全闡明脫適應(yīng)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制并制定有效的防治措施,需要進(jìn)一步深入研究。