miR-525及其靶基因ZNF395對(duì)胎兒發(fā)育的影響及其作用機(jī)制

曹文紅,靳 鈺,卜令真

(青島市婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)科,青島 266000)

胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)指足月分娩的新生兒體質(zhì)量低于2.5 kg,或新生兒體質(zhì)量不足同期新生兒體質(zhì)量平均值的90%[1]。FGR為新生兒嚴(yán)重并發(fā)癥之一,發(fā)病率為5%-10%,為引起新生兒死亡的主要因素之一,也可導(dǎo)致FGR新生兒患病率較正常體質(zhì)量新生兒高4-6倍[2]。FGR除對(duì)新生兒的生長發(fā)育存在一定影響,還可對(duì)大腦及心血管等系統(tǒng)發(fā)育造成不利影響[3]。導(dǎo)致胎兒生長受限的因素較多,如:胎盤、環(huán)境因素、遺傳因素等,因此對(duì)于FGR發(fā)病機(jī)制的研究一直以來為婦產(chǎn)科研究的熱點(diǎn)問題。胎盤為母嬰營養(yǎng)交換的唯一場所,功能異常時(shí),可導(dǎo)致母嬰營養(yǎng)交換異常,影響胎兒發(fā)育。目前學(xué)界多認(rèn)為胎兒發(fā)育受限受胎盤缺氧影響,但導(dǎo)致胎盤發(fā)育或激素分泌異常及缺氧機(jī)制尚未明確。有研究認(rèn)為可能與孕期疾病、母體心血管功能異常等因素導(dǎo)致胎兒無法獲得充足能量。胎盤發(fā)育早期受滋養(yǎng)細(xì)胞和血管形成影響[4,5],且已明確滋養(yǎng)細(xì)胞侵入及異常遷移可引起胎盤發(fā)育受限,降低母嬰血液交換,抑制胎兒的生長發(fā)育。上述研究均證實(shí)血管形成異常在FGR發(fā)病中具有重要的作用,但導(dǎo)致血管形成異常機(jī)制尚未明確。

miRNA為分子量為21-24個(gè)核苷酸的非編碼RNA,在促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及基因調(diào)控等方面具有重要的作用[6]。近些年有研究對(duì)孕婦血液中的多種miRNAs含量進(jìn)行檢測,結(jié)果表明其含量隨著妊娠時(shí)間增加不斷提高,但未發(fā)現(xiàn)這些miRNAs與子癇或FGR存在相關(guān)性[7]。但現(xiàn)階段對(duì)于FGR中miRNAs的研究還較為局限,對(duì)于胎盤或血漿中miRNA表達(dá)的研究還較少。孕期低氧環(huán)境可上調(diào)miR-525表達(dá),從而導(dǎo)致胎盤血管形成異常,引起母嬰氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)交換功能異常,抑制胎兒正常發(fā)育[8]。因此,本研究探討miR-525及其靶基因ZNF395對(duì)FGR發(fā)生的影響及作用機(jī)制,為FGR的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2018-01～2018-12我院婦產(chǎn)科收治的30例胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)新生兒胎盤組織為觀察組,選擇同期收治的30例正常體質(zhì)量新生兒胎盤組織為對(duì)照組。FGR診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]:足月分娩的新生兒體質(zhì)量低于2.5 kg,或新生兒體質(zhì)量不足同期新生兒體質(zhì)量平均值的90%,或妊娠37周時(shí)胎兒體質(zhì)量低于2.5 kg。對(duì)照組診斷標(biāo)準(zhǔn):以《婦產(chǎn)科學(xué)》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)為參考依據(jù)，2.5 kg<足月新生兒體質(zhì)量<4 kg。納入標(biāo)準(zhǔn):均為單胎妊娠,胎兒無先天性病變,無內(nèi)分泌或遺傳性或其他系統(tǒng)疾病。兩組新生兒Apgar評(píng)分均≥7分。兩組新生兒一般資料見表1。所有納入新生兒家屬知情同意且簽署知情同意書;本研究已獲取我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

表1 兩組新生兒一般臨床資料對(duì)比(n=30)

Table 1 Comparison of general clinical data of newborns between the two groups(n=30)

組別年齡(歲)孕周(周)新生兒體質(zhì)量(g)觀察組28.85±3.3939.21±1.692163.99±338.98對(duì)照組27.91±3.5139.47±1.563420.79±261.30t1.0550.61916.084P0.1480.269 0.000

1.2 主要試劑

microRNA提取試劑盒、microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、microRNA實(shí)時(shí)定量PCR(Taqman法)、miR-525及內(nèi)參U6反轉(zhuǎn)錄及PCR引物、ZNF395及內(nèi)參GAPDH反轉(zhuǎn)錄及PCR引物(購自于美國Sigma公司)、蛋白提取試劑(購自于碧云天生物技術(shù)公司)、考馬斯亮藍(lán)法蛋白測定試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)、GAPDH抗體(AG019-1)、二抗:辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(購自于碧云天生物技術(shù)公司)、ZNF395抗體(購自于圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)。

1.3 標(biāo)本采集

兩組產(chǎn)婦自然分娩后,取胎盤母面中央大小約為1 cm3組織,置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)檢測

采用microRNA提取試劑盒提取胎盤組織中的總RNA,隨后采用microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再采用real time-PCR對(duì)胎盤組織中的miR-525水平及內(nèi)參U6表達(dá)相對(duì)值進(jìn)行檢測。

采用real time-PCR對(duì)胎盤組織中ZNF395水平及GAPDH表達(dá)相對(duì)值進(jìn)行檢測。采用Western blotting對(duì)ZNF395蛋白轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測,內(nèi)參為GAPDH。

以上操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組胎盤組織miR-525表達(dá)水平對(duì)比

溶解曲線顯示本研究中內(nèi)參基因U6和miR-525 RCP擴(kuò)增無其他雜質(zhì),且Ct值內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含量與循環(huán)次數(shù)為指數(shù)關(guān)系,且尚未到達(dá)平臺(tái)期,可對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。結(jié)果見圖1。

采用RT-PCR法對(duì)兩組胎盤組織中的miR-525水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,FGR組胎盤組織中的miR-525表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

2.2 兩組胎盤組織miR-525靶基因ZNF395表達(dá)水平對(duì)比

溶解曲線顯示本研究中內(nèi)參基因GAPDH和靶基因ZNF395 RCP擴(kuò)增無其他雜質(zhì),且Ct值內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含量與循環(huán)次數(shù)為指數(shù)關(guān)系,且尚未到達(dá)平臺(tái)期,可對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。結(jié)果見圖3。

采用RT-PCR法及Western bloting法對(duì)兩組胎盤組織中ZNF395蛋白轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,觀察組胎盤組織中ZNF395 mRNA水平明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4,5)。

2.3 miR-525和靶基因ZNF395相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果表明,miR-525和ZNF395表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.666,P=0.001,見圖6)。

圖3 ZNF395及內(nèi)參GAPDH溶解與擴(kuò)增曲線

圖4 RT-PCR法檢測miR-525靶基因ZNF395表達(dá)水平

圖5 Western bloting法檢測miR-525靶基因ZNF395表達(dá)水平對(duì)比

圖6 FGR組胎盤組織miR-525和靶基因ZNF395表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

國外有學(xué)者對(duì)合并FGR孕產(chǎn)婦血漿中部分miRNA(miR-525、miR-517、miR-526a等)分析發(fā)現(xiàn)[7],隨著妊娠的不斷增加,這一類miRNAs含量也隨之不斷增加,表明miRNAs表達(dá)水平增加與FGR發(fā)生可能具有一定的相關(guān)性,而miRNAs具有作為診斷FGR的潛在標(biāo)志物的潛力;而在FGR孕婦胎盤組織中總miRNAs含量較正常妊娠孕婦明顯降低,由于在滋養(yǎng)細(xì)胞生長中miRNAs具有調(diào)控其靶基因的作用,從而影響FGR的發(fā)生。有學(xué)者對(duì)孕婦胎盤組織中的miRNAs進(jìn)行分析[9],發(fā)現(xiàn)miRNAs與胎兒發(fā)育受限相關(guān)。Mouillet等[10]通過對(duì)正常妊娠產(chǎn)婦和合并FGR產(chǎn)婦血漿部分缺氧miRNAs含量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)兩組研究對(duì)象每種miRNAs含量無差異,但合并FGR組血漿缺氧相關(guān)miRNAs含量為正常妊娠產(chǎn)婦的1.8倍,則表明血漿miRNAs含量增加可能與FGR具有相關(guān)性;與此同時(shí),研究通過對(duì)比正常妊娠產(chǎn)婦和合并FGR產(chǎn)婦胎盤組織中的miRNAs含量,對(duì)總miRNAs表達(dá)水平對(duì)比中發(fā)現(xiàn),合并FGR孕婦表達(dá)水平相比于正常妊娠孕婦低24%,但每種miRNAs含量無差異性。由上述研究可知,胎盤組織中的miRNAs的表達(dá)差異可能與FGR的發(fā)生具有一定的相關(guān)性,其機(jī)制可能為miRNA通過對(duì)其靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)從而影響胎盤特別是滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長。

但現(xiàn)階段對(duì)于miRNA與FGR相關(guān)性的研究較為局限,還需要進(jìn)一步的深入研究。有研究表明[11,12],miR-525、miR-424、miR205等在胎盤組織中存在特異性表達(dá)。其中,miR-16、miR-21等的異常表達(dá)對(duì)胎兒生長受限具有重要的作用[13,14]。而對(duì)于miR-525的研究中發(fā)現(xiàn)[8],miR-525受缺氧調(diào)控,若機(jī)體處于缺氧狀態(tài)時(shí),表達(dá)水平增加從而調(diào)控血管的形成。近些年來,在肝細(xì)胞癌研究中,miR-525通過介導(dǎo)靶基因ZNF395參與肝癌的發(fā)生發(fā)展,具有抑制血管生成的作用[15]。ZNF395是Kruppel C2H2型鋅指蛋白家族的成員之一,其在機(jī)體中表達(dá)較為廣泛,最初被鑒定為調(diào)節(jié)人乳頭瘤病毒(HPV)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(HPV-binding factor,PBF),具有與HPV啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的作用[15]。在缺氧條件下,ZNF395可在血管中大量表達(dá),具有促進(jìn)血管形成的作用[16]。Tsukahara等[17]發(fā)現(xiàn)ZNF395為腫瘤相關(guān)抗原物質(zhì)之一。且ZNF395也被證明具有通過激活caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路以抑制細(xì)胞生長的作用[18-20]。但現(xiàn)階段尚未見到關(guān)于ZNF395在FGR發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的報(bào)道。因此推測miR-525可能具有調(diào)控血管生成的作用。而胎盤血管形成異常則為引起胎兒發(fā)育受限的重要因素,因此miR-525可能對(duì)于胎兒的發(fā)育具有重要的影響作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),合并FGR孕婦胎盤組織中miR-525的表達(dá)水平較正常妊娠孕婦增加,而其靶基因ZNF395表達(dá)水平則降低。對(duì)miR-525和其靶基因ZNF395進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析表明,miR-525和靶基因ZNF395存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.666,P=0.001)。因此,推測miR-525可能通過抑制靶基因ZNF395的表達(dá),抑制胎盤尤其是滋養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)育,從而引起胎兒發(fā)育受限。

綜上所述,在生長受限胎兒胎盤組織中miR-525表達(dá)增加,靶基因ZNF395表達(dá)降低,miR-525通過介導(dǎo)靶基因ZNF395表達(dá)水平影響胎兒的發(fā)育。