CTSB和bFGF在高氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成中的表達

石麗洪,孔 麗*,周國宏,王文娟

(1山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室,太原 030001;2山西省眼科醫(yī)院淚道病科;*通訊作者,E-mail:183085520@qq.com)

視網(wǎng)膜新生血管形成(retinal neovascularization,RNV)是由多種病因引發(fā)的脈絡膜新生血管芽穿越Bruch膜并在視網(wǎng)膜色素上皮上、下增殖形成的纖維血管組織,常伴有視網(wǎng)膜下的漿液性滲出乃至出血,是多種眼底疾病,如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等,導致視功能損害的最主要原因[1]。高氧誘導小鼠是在體研究視網(wǎng)膜新生血管形成機制的主要模型之一[2]。據(jù)相關研究顯示,RNV形成過程中涉及多種信號分子表達水平改變,如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、組織蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)[3-5]、白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子(TNF-α)以及單核細胞趨化因子(MCP-1)[6]等。本課題組前期研究表明,CTSB和VEGF在RNV形成過程中可能存在雙向調(diào)節(jié)關系[3]。本研究旨在探討CTSB和bFGF在高氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成中的表達以及使用CA-074 Me抑制后二者表達水平的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理

7日齡清潔級C57BL/6J小鼠56只,雌雄不限,與母鼠(山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供,SCXK(晉)2015-0001)共同飼養(yǎng)。實驗條件及實驗動物均符合國家科學技術委員會的實驗動物管理條例。采用隨機數(shù)字表法將56只小鼠分為正常對照組、高氧誘導組、DMSO組和CA-074Me組,每組小鼠14只。正常對照組小鼠在普通環(huán)境下飼養(yǎng)5 d;高氧誘導組、DMSO組和CA-074Me組在高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d建立氧誘導視網(wǎng)膜病變模型;而后DMSO組和CA-074Me組小鼠玻璃體腔分別注射1 μl DMSO和1 μl CA-074Me,各1次,此時各組小鼠均為12日齡,而后均轉(zhuǎn)于標準環(huán)境中培養(yǎng)5 d,為17日齡小鼠。

1.2 主要試劑及儀器

CA-074 Me(美國Biomol公司);CA-074 Me溶于DMSO溶劑中,配制成濃度為100 mg/L的溶液;PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒和引物合成(日本Takara公司);RNA裂解酶(美國Sigma公司);兔抗鼠CTSB抗體、鼠抗鼠bFGF抗體;辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗;辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗(美國Santa Cruz公司)。氧體積分數(shù)為(75±2)%的密閉氧箱(青島科凱電子研究所有限公司);PCR儀、離心機(德國Eppendorf公司);多功能數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF mRNA表達水平

每組中隨機各取7只17日齡小鼠。經(jīng)頸椎脫臼法處死,摘取雙側(cè)眼球,剝離視網(wǎng)膜組織。采用RNA提取劑盒提取小鼠視膜總RNA,按RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,配置PCR反應液,以cDNA為模板分別對CTSB和bFGF進行PCR擴增。CTSB和bFGF基因引物序列(見表1)。反應結(jié)束后提取實吋聚合酶鏈式反應的擴增曲線和熔解曲線數(shù)據(jù),以β-actin基因作為內(nèi)參照,用2-ΔΔCt顯示相對表達量。

表1 CTSB和bFGF的引物序列

Table 1 Primer sequences of CTSB and bFGF

基因引物序列 CTSB上游:5′-GGCTTTGACTGCAGGACTTC-3′下游:5′-GACAGGACCAAGGAGAGGTG-3′bFGF上游:5′-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3′下游:3′-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-5′β-actin上游:5′-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3′下游:5′-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-3′

1.4 Western blot法檢測小鼠視網(wǎng)膜中VEGF和bFGF蛋白表達水平

每組中隨機各取17日齡小鼠7只。經(jīng)頸椎脫臼法處死，摘取雙側(cè)眼球,剝離視網(wǎng)膜組織。用裂解液裂解小鼠視網(wǎng)膜，置于1.5 ml Eppendorf管中，超聲勻漿，4 ℃ 10 000g離心10 min，取上清，蛋白定量，加入等體積2倍SDS緩沖液，95 ℃煮沸5 min，迅速冰浴，4 ℃ 10 000g離心10 min，收集上清。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳法進行分離(VEGF用質(zhì)量分數(shù)8%的分離膠，bFGF用質(zhì)量分數(shù)15%的分離膠)，電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，質(zhì)量分數(shù)5%BSA溶液，4 ℃封閉3 h；分別加入兔抗鼠CTSB抗體(1∶1 000稀釋)或鼠抗鼠bFGF抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌，再加入相應二抗(1∶10 000稀釋)，孵育2 h，洗滌；ECL底物化學發(fā)光，顯影，定影，掃描。以β-actin為內(nèi)參，通過Photoshop圖像軟件分析，以CTSB/β-actin，bFGF/β-actin的比值表示各組組織中CTSB和bFGF蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠視網(wǎng)膜中CTSB、bFGF mRNA相對表達水平

正常對照組、高氧誘導組、DMSO組和CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中bFGF mRNA相對表達量分別為0.67±0.23,21.4±3.07,17.22±2.63和0.96±0.35,各組bFGF mRNA相對表達量總體比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=226.89,P=0.000)。正常對照組、高氧誘導組、DMSO組和CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB mRNA相對表達量分別為0.26±0.11,9.92±3.30,6.36±4.15和0.48±0.29,各組CTSB mRNA相對表達量總體比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=25.23,P<0.05)。與對照組比較,高氧誘導組和DMSO組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF mRNA的相對表達量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF mRNA相對表達水平明顯低于高氧誘導組(P<0.05)。正常對照組和CA-074Me組比較,高氧誘導組和DMSO組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。

與正常對照組比較,*P<0.05;與高氧誘導組比較,#P<0.05

2.2 小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)bFGF和CTSB蛋白相對表達水平

正常對照組、高氧誘導組、DMSO組和CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中bFGF蛋白相對表達量分別為0.38±0.02,0.91±0.07,0.95±0.05和0.59±0.08,各組bFGF蛋白相對表達量總體比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=121.84,P<0.05)。CTSB蛋白相對表達量分別為0.42±0.07,0.97±0.13,0.97±0.13和0.71±0.12,各組CTSB蛋白相對表達量的總體比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(F=30.69,P=0.000)。與對照組比較,高氧誘導組和DMSO組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF蛋白的相對表達量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF蛋白相對表達水平明顯低于高氧誘導組和DMSO組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常對照組和CA-074Me組比較,高氧誘導組和DMSO組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖2)。

與正常對照組比較,*P<0.05;與高氧誘導組比較,#P<0.05

3 討論

RNV形成是缺血、缺氧性視網(wǎng)膜疾病發(fā)展到終末階段的特征性表現(xiàn),如增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變[7]。新生血管管壁發(fā)育不成熟、基底膜不完整,導致血管內(nèi)大分子滲漏至組織間隙,進而出現(xiàn)玻璃體和視網(wǎng)膜前、后出血。若反復積血且不能完全吸收,玻璃體腔的血性物質(zhì)就會發(fā)生濃縮、機化、增殖、牽拉,從而引起黃斑水腫,發(fā)生部分或完全牽拉性視網(wǎng)膜脫離,進而殃及其鄰近組織,繼發(fā)睫狀體、脈絡膜脫離等嚴重并發(fā)癥[8]。正常眼組織能夠維持血管生成的穩(wěn)定性是基于血管生成刺激因子(如VEGF、bFGF等)和血管生成抑制因子(如色素上皮衍生因子PEDF)共同作用的結(jié)果。兩者之間關系失衡是促使RNV形成的最主要原因[9]。另外,細胞外基質(zhì)(ECM)固有成分中的膠原蛋白、彈性蛋白等經(jīng)酶解后可促進RNV形成[10]。

bFGF也稱FGF2,具有促分化、促增殖、營養(yǎng)神經(jīng)及抑制凋亡等作用。動物試驗中,已有研究表明bFGF與VEGF同時注入玻璃體腔視網(wǎng)膜血管病變最重[11]。給青紫藍兔視網(wǎng)膜下注射bFGF能誘導其視網(wǎng)膜下新生血管形成[12]。bFGF可通過旁分泌和自分泌途徑作用于視網(wǎng)膜各層細胞,并促進其他生長因子分泌。在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病過程中,局部組織缺血、缺氧導致視網(wǎng)膜細胞bFGF分泌,從而刺激視網(wǎng)膜色素上皮細胞和內(nèi)皮細胞增殖,導致血管腔狹窄、閉塞,加重視網(wǎng)膜血循環(huán)障礙[13]。同時,bFGF能夠顯著激活炎性反應的一個重要轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及增加其下游與炎癥有關的細胞因子白介素-8(IL-8)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的基因表達,增加血管通透性,利于內(nèi)皮細胞遷移、增殖[14]。

CTSB是一種半胱氨酸組織蛋白酶,以酶原形式儲存于溶酶體中,參與體內(nèi)多種蛋白的水解。正常情況下,大約10%的酶原被生理性分泌至胞漿。病理狀態(tài)下,各種原因所致的細胞損傷導致溶酶體膜穩(wěn)定性降低、通透性增高甚至破裂,大量CTSB釋放到胞漿或組織間隙并被激活,介導細胞炎性壞死及凋亡[15]。高氧誘導小鼠模型中CTSB表達水平增加,活性增強,加速ECM降解,使ECM結(jié)構(gòu)改變,還可促進ECM釋放bFGF[15]。

CA-074 Me是CTSB的特異性抑制劑,能抑制視網(wǎng)膜新生血管中CTSB的表達[16]。本實驗中,高氧誘導小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF表達上調(diào)。給小鼠玻璃體腔注射CA-074 Me抑制高氧誘導小鼠視網(wǎng)膜組織中CTSB的表達,此時發(fā)現(xiàn)bFGF表達下調(diào)。這一機制可能是,CA-074 Me通過抑制CTSB來抑制bFGF的表達;也可能是CA-074 Me直接作用于bFGF,其具體機制需要我們在后期的實驗中進一步驗證。