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    Bacillus subtilis VD18R19脂肽類產(chǎn)物鑒定及其對(duì)胡椒花葉病的田間生防效果①

    2019-12-10 02:13:18高圣風(fēng)劉愛(ài)勤茍亞峰孫世偉孟倩倩
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年10期
    關(guān)鍵詞:脂肽生防菌花葉病

    高圣風(fēng) 王 鋒 劉愛(ài)勤 茍亞峰 孫世偉 王 政 孟倩倩

    (1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所 海南萬(wàn)寧571533;2海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南萬(wàn)寧571533;3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院 云南普洱665000)

    芽孢桿菌(Bacillusspp.)廣泛存在于自然環(huán)境中,具有綠色、廣譜、易培養(yǎng)、耐儲(chǔ)藏、耐逆境等特點(diǎn),是目前研究最廣泛、最深入的根際促生細(xì)菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria,PGPR)種類之一[1-2],也是中國(guó)登記、使用最多的生防菌之一。脂肽類化合物是芽孢桿菌產(chǎn)生的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物,包括表面活性素(Surfactins)、伊枯草菌素(Iturins)和泛革素(Fengycins)等抗生素家族,具有抑制病原菌、誘導(dǎo)寄主抗性、促進(jìn)植株生長(zhǎng)等多種生防活性[3-4]。如B.amyloliquefaciensVX2R11 產(chǎn)生的表面活性素和伊枯草素對(duì)香草蘭根(莖)腐病菌(Fusarium oxysporum)、疫病菌 (Phytophthora nicotianae)和香草蘭細(xì)菌性軟腐病菌(Dickeya dadantii)等病原真菌、卵菌和細(xì)菌具有良好的的抑制菌絲生長(zhǎng)效果[5];B.subtilis9407產(chǎn)生的泛革素能夠有效防控蘋果輪紋?。?];表面活性素高產(chǎn)菌株B.subtilisOKBHF能刺激番茄產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性 (Induced Systemic Resistance,ISR)物質(zhì),有效防控番茄青枯病和花葉病毒病[7-8]。

    胡椒(Piper nigrumLinn.)是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的多年生香料作物,廣泛種植于世界熱區(qū)各國(guó),目前中國(guó)胡椒種植面積居世界第6位。胡椒花葉病是由黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus,CMV)引起的胡椒病毒性病害,普遍發(fā)生于中國(guó)各胡椒產(chǎn)區(qū),可造成約30%的經(jīng)濟(jì)損失,是危害中國(guó)胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害之一[9-10]。但實(shí)際生產(chǎn)往往缺乏有效防控胡椒花葉病手段,國(guó)內(nèi)外也尚未有利用PGPR防控胡椒花葉病的報(bào)道。

    生防菌B.subtilisVD18R19是近年來(lái)分離的生防菌株,具有定殖能力強(qiáng)、防病譜廣、易遺傳轉(zhuǎn)化等特點(diǎn),已被完全測(cè)序[11-12]。通過(guò)比較基因組學(xué)研究預(yù)測(cè),VD18R19基因組中含有2個(gè)脂肽類化合物編碼基因簇[13]。本研究開(kāi)展B.subtilisVD18R19脂肽類產(chǎn)物提取、鑒定研究,分析該菌株及其脂肽類化合物對(duì)胡椒花葉病的生防效果,為利用生防芽孢桿菌防控胡椒花葉病提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株及處理液

    生防菌株B.subtilisVD18R19來(lái)源于海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,保存于-80℃培養(yǎng)基中。VD18R19處理液是生防菌發(fā)酵液離心收集菌體后重懸至107cfu/g的菌懸液(自制);脂肽類化合物處理液是生防菌脂肽類提取物(自制)稀釋1 000倍液;阿泰靈處理液是植物免疫調(diào)節(jié)劑阿泰靈(北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司)稀釋1 000倍液;清水對(duì)照是農(nóng)田灌溉用水。所有處理液均用灌溉用水稀釋。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    生防菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)uria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母粉,去離子水定容至1 000 mL,121℃滅菌20 min。生防菌發(fā)酵所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)andy培養(yǎng)基:5 g L-谷氨酸、0.5 g MgSO4、0.5 g KCl、1 g酵母粉、1.5×10-4g Fe2SO4·6H2O、 5.0×10-3g MnSO4·H2O、 1.6×10-4g CuSO4·5H2O、2.0×10-3g L-苯丙氨酸,定容至1 000 mL,pH調(diào)至7.0,121℃滅菌20 min,使用前補(bǔ)充2%的葡萄糖和1‰的KH2PO4。

    1.1.3 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)地點(diǎn)為瓊海市大路鎮(zhèn)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所試驗(yàn)基地;選擇已種植約2年、長(zhǎng)勢(shì)均一、花葉病病株率為6.67%、病株分布均勻、30 d前統(tǒng)一修剪了主蔓的胡椒園。

    1.2 方法

    1.2.1 VD18R19的發(fā)酵及脂肽類化合物的提取

    將生防菌株B.subtilisVD18R19接種到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中,于37℃200 r/min震蕩培養(yǎng)12 h。然后將培養(yǎng)液按3%比例轉(zhuǎn)接到裝有1 000 mL Landy培養(yǎng)基的三角瓶中,于30℃200 r/min震蕩發(fā)酵30 h。采取酸沉淀法提取脂肽類化合物[14]:即將生防菌發(fā)酵液8 000 g離心10 min,保留上清液;將上清液pH調(diào)至2.0,靜置2h,8000g離心10 min,收集沉淀,60℃恒溫干燥箱至完全干燥,即為粗提物;加入10 mL甲醇(色譜純),pH調(diào)至7.0,充分搖勻溶解,12 000 g離心5 min,保留上清液。將多次提取的上清液合并,用尼龍濾膜(孔徑,50μm)過(guò)濾,將獲得的提取物于-20℃保存?zhèn)溆?。為估算脂肽類化合物產(chǎn)量,隨機(jī)抽取3份生防菌發(fā)酵液,每份1 000 mL,將粗提物和提取物分別放入60℃烘箱干燥至恒重后稱取干重。

    1.2.2 脂肽類化合物鑒定

    將1.2.1中脂肽類化合物通過(guò)AB SCIEX 5800儀器進(jìn)行質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)檢測(cè),用337 nm氮激光源解吸附和電離。使用的基質(zhì)是α-氰-4-羥肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)。

    1.2.3 田間防控胡椒花葉病試驗(yàn)

    設(shè)置生防菌VD18R19、脂肽類化合物提取物、植物免疫誘抗劑(阿泰靈)和清水對(duì)照4個(gè)處理,每處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20株胡椒。各處理液配好后同時(shí)進(jìn)行灌根(2.5 L/株)和葉面噴霧處理,60 d后依照病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查各處理胡椒花葉病嚴(yán)重度,并計(jì)算病情指數(shù)和防效。同時(shí)測(cè)量胡椒冠幅、最大果枝長(zhǎng)度,計(jì)算促生率。另從各處理中選出長(zhǎng)勢(shì)和病情較為一致的植株進(jìn)行定點(diǎn)編號(hào),記錄處理前后的植株長(zhǎng)勢(shì)和病害情況。

    胡椒花葉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí),無(wú)病害癥狀;1級(jí),病葉率<5%;3級(jí),5%≤病葉率<15%;5級(jí),15%≤病葉率<35%;7級(jí),35%≤病葉率<75%;9級(jí),病葉率≥75%。

    1.2.4 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),費(fèi)雪最小顯著差異檢驗(yàn)(Fisher’s least-significant difference test,LSD)(p<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Bacillus subtilis VD18R19脂肽類產(chǎn)物提取和鑒定

    生防菌VD18R19發(fā)酵液中可以提取到脂肽類化合物,其粗提物和提取物的平均產(chǎn)量分別為5.92、3.13 g/L。由圖1可知,MALDI-TOF/TOF-MS檢測(cè)結(jié)果顯示有2簇峰:在m/z值為988·4123、1002·4224、1016·4399、1032·4147、1 044·6182、1060·6017 處有離子峰出現(xiàn),這簇離子峰對(duì)應(yīng)于表面活性素的分子質(zhì)量;在m/z值為1471.7305、1485.7479、1499.7640、1513.7786、1529.7640處有離子峰出現(xiàn),這簇離子峰對(duì)應(yīng)于大側(cè)柏素分子質(zhì)量。這說(shuō)明生防菌VD18R19能夠大量產(chǎn)生脂肽類化合物,主要為表面活性素和大側(cè)柏素2種成分。

    2.2 田間生防效果

    由表1可知,相對(duì)于清水對(duì)照,灌根和噴霧處理60 d后,生防菌VD18R19、脂肽類提取物和阿泰靈3處理均能有效降低胡椒花葉病的嚴(yán)重度,其中生防菌VD18R19和脂肽類提取物2處理的防效較好,分別達(dá)79.49%、87.18%;此外,3處理對(duì)胡椒的生長(zhǎng)均有一定程度的促進(jìn)作用,其中VD18R19對(duì)胡椒冠幅和最大果枝長(zhǎng)度的促進(jìn)作用達(dá)顯著水平(LSD,p<0.05), 促 生 率 分 別 為 10.10% 和15.55%,。由表2、圖2~3可知,處理前病情分級(jí)為3、5級(jí),葉片斑駁扭曲,病葉較窄,病枝節(jié)間距較短,病情和長(zhǎng)勢(shì)較為一致,處理間差異均不顯著。處理60 d后,清水對(duì)照的病情分級(jí)上升為7級(jí),新葉更小且嚴(yán)重斑駁扭曲,新枝節(jié)間距更加縮短;其他處理病情分級(jí)均降至1級(jí),新生葉片形狀、顏色基本正常(僅阿泰靈處理的新葉顏色略顯斑駁),新葉寬度和新枝節(jié)間距均有明顯增加,統(tǒng)計(jì)數(shù)值顯著高于清水對(duì)照。說(shuō)明生防菌VD18R19及其脂肽類提取物均具有良好的防控胡椒花葉病和促進(jìn)植株生長(zhǎng)效果,具有良好的應(yīng)用潛力。

    圖1 脂肽類提取物MALDI-TOF/TOF-MS檢測(cè)結(jié)果

    表1 不同處理對(duì)胡椒花葉病的田間生防效果

    表2 處理前后代表植株感病部位的病害嚴(yán)重度

    3 結(jié)論與討論

    枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物主要有伊枯草菌素、泛革素和表面活性素3大家族,其中伊枯草菌素、泛革素具有較強(qiáng)的抑制真菌和卵菌活性,而表面活性素對(duì)眾多卵菌、真菌、細(xì)菌、支原體、病毒、腫瘤細(xì)胞等具有廣譜抑制活性,被廣泛應(yīng)用于生物制藥和作物病害防治[3-8]。本研究發(fā)現(xiàn),B.subtilisVD18R19能產(chǎn)生表面活性素和大側(cè)柏素2種脂肽類化合物,分屬表面活性素家族和泛革素家族。田間試驗(yàn)表明,該菌株及產(chǎn)生的脂肽類化合物對(duì)胡椒花葉病表現(xiàn)出良好的防治效果,防效分別達(dá)79.49%和87.18%,極具應(yīng)用潛力。

    通過(guò)比較基因組學(xué)預(yù)測(cè)B.subtilisVD18R19含有表面活性素和大側(cè)柏素2個(gè)脂肽類化合物編碼基因簇[13],與本研究脂肽類化合物質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。粗提物干重為5.92 g/L,接近于王帥等報(bào)道的產(chǎn)量[14],遠(yuǎn)高于劉佳欣等的報(bào)道[15]。但本研究的提取物未進(jìn)行液相色譜純化,提取物干重不宜與純化后的干重直接進(jìn)行比較。

    圖2 不同處理對(duì)代表性病株的影響

    圖3 代表植株感病部位在處理前后的病害情況

    有研究顯示,B.subtilisVD18R19對(duì)多種胡椒和香草蘭病原真菌、卵菌和細(xì)菌具有生防活性[5,11-12]。本研究再次拓寬B.subtilisVD18R19的活性范圍,證實(shí)了該菌株具有防控胡椒花葉病活性。Wang等[7]通過(guò)酶聯(lián)免疫方法對(duì)盆栽番茄進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)生防菌B.subtilisOKB105和B.amyloliquefaciensFZB42灌根處理能夠顯著降低新葉中黃瓜花葉病毒的數(shù)量;OKB105菌株能產(chǎn)生表面活性素[16],F(xiàn)ZB42菌株能產(chǎn)生表面活性素、Bacillomycin D和泛革素[17]。本研究中,菌株B.subtilisVD18R19產(chǎn)生表面活性素和泛革素。田間試驗(yàn)證實(shí),該菌株及脂肽類化合物均能有效防控胡椒花葉病,這在胡椒花葉病生物防治上尚屬首例,但有關(guān)防控胡椒花葉病的具體機(jī)制有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。

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