8種市售“金花”茶中微生物的分離鑒定①

楊瑞娟 王橋美 彭文書 季愛兵 張文杰 嚴(yán) 亮

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明650201;2普洱茶研究院 云南普洱665000;3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 云南昆明650201;4滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院 云南普洱665000)

茯磚茶早期稱“湖茶”，功效類似于土茯苓，所以又稱“茯茶”，比較有名的有安化黑茶、涇陽茯磚等，是古老茶類黑茶中的高檔茶。微生物在茯磚茶的形成中，有不可替代的作用［1］。普洱茶產(chǎn)于云南，是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種茶為原料，經(jīng)殺青、揉捻、曬干制成曬青毛茶，再經(jīng)人工灑水，渥堆微生物發(fā)酵之后而成的后發(fā)酵茶類，微生物代謝產(chǎn)生的多種生化產(chǎn)物，形成了普洱茶多樣化的風(fēng)味［2］。白茶也是我國六大茶類之一，福鼎是中國的白茶之鄉(xiāng)，是白茶的主要產(chǎn)區(qū)和出口基地［3］，為滿足廣大消費(fèi)者的需求，白茶的加工工藝也在創(chuàng)新和發(fā)展。

“金花”民間稱“金花菌”，能分泌多種胞外酶催化茶葉化合物的轉(zhuǎn)化，改善茶葉品質(zhì)［4］。在茶葉上人工接種冠突散囊菌能夠顯著地提高茶葉的抗氧化活性，增強(qiáng)防止脈粥樣硬化能力，冠突散囊菌發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物也顯示出較好的抗菌及抗腫瘤作用［5］。以冠突散囊菌為代表的“金花菌”對于黑茶磚茶色澤、風(fēng)味、品質(zhì)具有重要的影響［6］。

傳統(tǒng)的茯磚茶有發(fā)花工藝，常常以“金花”含量的多少來衡量其品質(zhì)的好壞，但是傳統(tǒng)的普洱茶和緊壓白茶并無發(fā)花工藝。隨著茶保健功效的突出，越來越受廣大消費(fèi)者的歡迎，各種茶都出現(xiàn)了一些創(chuàng)新工藝，比如市面上銷售的增加了發(fā)花工藝的“金花”老白茶、“金花”普洱茶等。為避免劣質(zhì)茶葉充斥市場，避免消費(fèi)者誤將發(fā)霉的磚茶當(dāng)作“金花”茶，筆者基于傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法及DNA測序鑒定技術(shù)，對市售的含有“金花”的8種茶樣（陜西及湖南的茯磚茶、福建老白茶、普洱生茶、普洱熟茶）的微生物進(jìn)行了分離鑒定，旨在揭示各種“金花”茶內(nèi)含微生物的種類及各種茶微生物之間的區(qū)別與聯(lián)系，為“金花”茶生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶樣

T1：涇陽茯磚（產(chǎn)自陜西，長方磚形，磚面緊實，色澤黑褐，磚內(nèi)金黃色顆粒，干嗅有黃花清香）；T2：牛金花茯磚（產(chǎn)自陜西，長方磚形，磚面磚內(nèi)都有金黃色顆粒）；T3：涇渭茯茶（產(chǎn)自陜西，長方磚形，茶梗明顯，磚面略松散，色澤黑褐，磚內(nèi)少量金黃色顆粒）；T4：安化黑茶（產(chǎn)自湖南，長方磚形，磚面略松散，黃片明顯，色澤黑褐，磚內(nèi)少量金黃色顆粒，有淡淡的菌花香）；T5：安化黑茶黃片（產(chǎn)自湖南，長方磚形，壓制較松散，色澤黃褐，略見金黃色顆粒）；T6：福鼎金花老白茶（產(chǎn)自福建，長方小磚，壓制略松散，色澤黃褐，略見金黃色顆粒）；T7：普洱熟茶（產(chǎn)自云南，長方磚形，壓制緊實，色澤褐紅，略見金黃色顆粒，陳香）；T8：普洱生茶（產(chǎn)自云南，長方磚形，壓制緊實，色澤黃綠，磚內(nèi)少量金黃色顆粒，蘭花香）。茶樣見圖1。

圖1 T1～T8茶樣

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂18 g/L。

YEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離

“金花”的分離：在無菌條件下，用無菌接種針挑取茶葉上黃色閉囊殼或直接挑取帶有黃色閉囊殼的茶葉碎片接入PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)72 h，進(jìn)一步純化后置于28℃培養(yǎng)。

在無菌條件下，采用LB和YEPD培養(yǎng)基，同一茶餅采用多點取樣，混勻，進(jìn)行其他可培養(yǎng)微生物的分離［7］。

1.2.2 菌種的鑒定

對菌種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增［8］，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州華大基因測序，根據(jù)測序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中挑選與靶系列相似度為100%的參考菌株系列，完成菌種鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樣中“金花”培養(yǎng)圖片及分子鑒定結(jié)果

經(jīng)過多次重復(fù)實驗，對8個茶樣中的“金花”菌進(jìn)行分子鑒定，從茶樣T1、T3和T5中分離得到冠突曲霉Aspergillus cristatus（KM388844.1、KF923733.1、LT670939.1），從茶樣T2、T4和T8中分離得到冠突曲霉Aspergillus cristatus（LT670938.1、LT670946.1、KJ018706.1） 和冠突散囊菌Eurotiumcristatum（KR812327.1、KC865304.1、JQ743649.1），從茶樣T6和T7中分離得到冠突散囊菌Eurotium cristatum（KR812327.1和KT151565.1），見圖2。冠突散囊菌是冠突曲霉的有性型，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的一種真菌，屬于“益生菌”，可生長在土壤、茯磚茶、冬蟲夏草、中藥片、沉香、木屑等基物上。

圖2 T1～T8“金花”培養(yǎng)圖

2.2 可培養(yǎng)微生物鑒定結(jié)果

由表1可知，T1、T2、T3中分別含有微生物15、7和8種，僅TI茶樣中有微生物Aspergillus appendiculatus，T1、T2、T3 3個茶樣都有微生物Aspergillus intermedius和Eurotium amstelodami，T2和T3茶樣中有微生物Aspergillus ruber。T4和T5分別含有微生物7種和12種，T4和T5兩茶樣中都有微生物Aspergillussp.6 VH-2016，僅T5茶樣中有微生物Aspergillus gracilis，曲霉屬是普洱茶發(fā)酵中的優(yōu)勢菌，在茯磚茶的發(fā)酵中也常被分離鑒定出來。T6所含微生物有16種。T7所含微生物有18種，假黃曲霉Aspergillus pseudoelegans、針刺曲霉Aspergillus spiculosus、桔青霉Penicillium citrinum和灰黃青霉Penicillium griseofulvum是T7茶樣中獨(dú)有的。T8所含微生物有18種，Absidia corymbifera、Aspergillusostianus、Lichtheimiacorymbifera和Lichtheimia ornata是T8茶樣中獨(dú)有的，Absidia corymbifera在酒曲中及蔗糖的發(fā)酵中也較常見，有很好的工業(yè)應(yīng)用價值。

表1 茶樣中其他可培養(yǎng)微生物

續(xù)表1 茶樣中其他可培養(yǎng)微生物

續(xù)表1 茶樣中其他可培養(yǎng)微生物

續(xù)表1 茶樣中其他可培養(yǎng)微生物

2.3“金花”茶樣所含微生物比較

由圖3可知，同是“金花”茶，茶樣中表現(xiàn)出了一些共有微生物，如8個茶樣中都分離鑒定出了阿姆斯特丹曲霉和謝瓦氏曲霉，但是由于不一樣的加工工藝，茯磚茶、白茶、普洱茶中的微生物又各有不同。具體如下：（1）同一產(chǎn)地同一類茶中有一些共有的微生物，如，阿姆斯特丹散囊菌是T1、T2、T3 3個茯磚茶樣中共有的，且此菌在茯磚茶里比較常見；Aspergillus ruber是T2和T3兩個茯磚茶樣中共有的；Aspergillus melleus、Aspergillusochraceus、Aspergillus sclerotiorum、Aspergillus westerdijkiae及Eurotium herbariorum是T7和T8兩個普洱茶樣中共有的。（2）不同產(chǎn)地的同一類茶亦有共同的微生物，如，阿姆斯特丹曲霉、謝瓦氏曲霉和赤散囊菌Eurotium rubrum是T2、T3、T4茶樣中共有的，T2、T3產(chǎn)地是陜西，T4產(chǎn)地是安化，但都屬于黑茶中的茯磚茶。（3）不同產(chǎn)地不同類別的茶樣中會含有同種微生物，如，Aspergillus montevidensis和Eurotium rubrum是T1～T6茶樣中共有的；高滲散囊菌Eurotium tonophilum是T6和T8茶樣中共有的；蠟葉散囊菌Eurotium herbariorum是T1、T7和T8茶樣中共有的；假灰綠曲霉Aspergillus pseudoglaucus是T1和T7中共有的。（4）有些微生物是某些茶樣中獨(dú)有的，如，Aspergillus gracilis是T5茶樣中獨(dú)有的，桔青霉和灰黃青霉是T7茶樣中獨(dú)有的，Lichtheimia corymbifera是T8茶樣中獨(dú)有的。

3 討論

冠突散囊菌和冠突曲霉目前市面上都被稱為“金花”，除了DNA序列分析，還要通過菌株的表觀形態(tài)、光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡等方法［9］才能具體確認(rèn)兩者的區(qū)別，冠突曲霉通過有性發(fā)育可以產(chǎn)生冠突散囊菌［10］，茯磚茶中比較常見，“金花”越多，茶葉品質(zhì)上表現(xiàn)為口感更加甜滑甘爽，且湯色更紅艷明亮，對消化系統(tǒng)及睡眠的改善效果顯著［11］，關(guān)于茯磚茶中的“金花”及其他微生物的研究已經(jīng)很多，但是最近市面上出現(xiàn)了“金花”白茶、“金花”普洱等新產(chǎn)品，對于新茶產(chǎn)品中的“金花”是否與茯磚茶中的一致，抑或其他有害微生物，人們的質(zhì)疑比較多，相關(guān)的研究也很少，筆者以市面上能買到的幾種“金花”茶為樣品，對“金花”菌進(jìn)行了培養(yǎng)和測序鑒定，發(fā)現(xiàn)白茶和普洱茶種的“金花”不是有害微生物，而是冠突散囊菌或者冠突曲霉，所以“金花”白茶、“金花”普洱可以放心飲用。

除了對8種茶樣品中的“金花”進(jìn)行了鑒定，筆者還分離出了一些功能微生物，如，阿姆斯特丹散囊菌可以用于去除污水中反流產(chǎn)物的染色問題［12-13］；Aspergillus ruber可以生產(chǎn)單寧酶，且產(chǎn)量較高［14］。蜂蜜曲霉Aspergillus melleus可以制備AMP脫氨酶、Aspergillus sclerotiorum的次級代謝產(chǎn)物可以抗腫瘤［15］，Eurotium tonophilum中含抗利什曼病的化合物［16］，Eurotium herbariorum對K562腫瘤細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性［17］，假灰綠曲霉與冠突曲霉功能類似，能夠在黑茶內(nèi)產(chǎn)生金花［18］，Aspergillus gracilis能分泌廢水生物修復(fù)中的酶，桔青霉可以降解聚乙烯材料［19］，也有一些隨著條件變化可以產(chǎn)生有害物質(zhì)的微生物，如Aspergillus ochraceus、Aspergillus westerdijkiae等，條件控制不當(dāng)可以產(chǎn)生赭曲霉毒素［20-21］等，這些微生物的分離對茶功能研究提供了理論基礎(chǔ)。

圖3 茶樣所含微生物的網(wǎng)絡(luò)圖

近年，普洱茶相關(guān)微生物的研究也很多，但“金花”普洱屬于新興產(chǎn)品，相關(guān)研究還很少。白飛榮等［22］研究表明，普洱茶發(fā)酵中可培養(yǎng)的優(yōu)勢真菌為Aspergillus luchuensis、Aspergillusneoniger、Aspergillusfumigatus、Penicilliumsp.、Cladosporium sp.等，但是本文中的“金花”普洱卻發(fā)現(xiàn)了大量的Aspergillus amstelodami、Aspergillus pseudoelegans、Aspergillusspiculosus、Eurotium herbariorum等真菌，說明普洱茶中增加發(fā)花工藝，可能影響普洱茶中可培養(yǎng)真菌的種類和數(shù)量。白茶屬于輕微發(fā)酵茶，微生物對茶葉品質(zhì)的影響很小，常規(guī)白茶微生物的研究很少，且更不可能含有“金花”，但是筆者從福鼎老白茶中分離出來的微生物種類很多，且跟茯磚茶的微生物種類很相似，有可能是發(fā)花工藝所影響。陳勇強(qiáng)［3］也從市售“金花”福鼎緊壓白茶中分離得到“金花”典型菌株，馬燕等［23］亦從“金花”普洱茶中分離鑒定出Lichtheimia corymbifera，這些均與本研究結(jié)論一致。

“金花”普洱茶、“金花”老白茶屬于創(chuàng)新工藝生產(chǎn)的茶，與傳統(tǒng)的的普洱茶和白茶口感及微生物的種類都有所差別，相關(guān)研究也很少。白茶、普洱茶等傳統(tǒng)名茶增加發(fā)花工藝從而也自帶“金花”，會不會影響茶葉的品質(zhì)、內(nèi)含物質(zhì)及口感，會不會對人體產(chǎn)生別的影響還有待進(jìn)一步驗證。鑒于安全性考慮，“金花”茶中優(yōu)勢菌種的功能、酶學(xué)特征及安全性評價也是下一步的研究重點。