圍絕經期動物模型建立方法的研究進展

楊溢鐸 李 佶

圍絕經期是女性自生育期的規(guī)律月經過渡到絕經即永久性無月經狀態(tài)的階段，包括從出現與卵巢功能下降有關的內分泌、生物學和臨床特征起至末次月經后一年。建立圍絕經期動物模型，模仿人類自然圍絕經期的卵巢功能變化，可以幫助研究圍絕經期遠期疾病和卵巢儲備功能下降的發(fā)病機制。本文回顧分析了近年來常用的制備圍絕經期動物模型的方法，通過比較各類模型的優(yōu)勢和劣勢，以期尋找出制備圍絕經期的理想動物模型。

一、去勢模型

最早的圍絕經期動物模型主要是去勢模型，即手術完全或部分摘除大鼠或小鼠的兩側卵巢。臧凱等[1]選取3月齡雌性未孕SD大鼠，完全切除或部分切除大鼠的卵巢，術后21只各組大鼠腹主動脈采血的結果均示血清雌二醇(E2)水平顯著降低，卵泡刺激素(FSH)水平顯著升高，子宮組織形態(tài)學顯示各去勢組大鼠子宮內膜上皮呈不同程度的萎縮變薄，間質、腺體稀疏，血管減少，結論證明采取手術去勢方法制備圍絕經期大鼠模型具有可行性。

去勢模型分完全去勢和部分去勢，完全去勢即摘除雙側卵巢較摘除部分卵巢操作簡單，并且適用范圍更廣。因為卵巢血供豐富，摘除一側的部分卵巢不易止血，并且摘除部分的多少不能定量，往往憑借操作者的主觀感受。雖然摘除部分卵巢更符合女性圍絕經期存在卵巢這一事實，但是手術操作影響卵巢的血供，殘存卵巢的功能無法評估，模型之間差異大，無法做到標準化。更重要的是卵巢切除后，除雌激素、孕激素水平下降外，一些卵巢分泌的其他激素如雄激素也會降低，這些激素可能在圍絕經期中起重要的作用，并對下丘腦和垂體分泌的激素有反饋作用[2]。摘除卵巢后，雌激素、促黃體生成素、卵泡刺激素和促性腺激素釋放激素(GnRH)的中樞調節(jié)器也將隨之被耗竭，而這些激素均對大腦有激活作用[3]。同時還存在其他問題需要解決，如大鼠去勢手術的最佳年齡，因為青年鼠和老年鼠對雙側卵巢切除有不同的反應。與年長動物比較，青年鼠的血清雌激素水平下降地更快。此外，對于部分去勢手術中另一側卵巢的保留體積，目前仍沒有定論，需要去進一步探索。

總體來說，去勢模型成功率高，操作簡便，使用廣泛，結局可靠，手術完成后雌激素的水平迅速下降，絕經中雌激素降低的診斷標準更容易達到[4]。但是自然的圍絕經期激素水平波動幅度很大，并且是在正常水平上下的波動，激素水平并非立即降低。所以去勢模型更適合用于絕經后期相關疾病的研究及人工絕經后的病理研究。同時，兩種去勢模型對于圍絕經期常見的烘熱汗出、憂郁健忘、心悸失眠等臨床癥狀都沒能很好體現。

二、藥物損傷卵巢模型

藥物損傷卵巢模型一般采用抗腫瘤藥物，免疫抑制劑等有生殖毒性的藥物通過腹腔注射或灌胃的方式連續(xù)給藥一段時間后，造成卵巢功能的下降，從而制備圍絕經期的動物模型。張娟等[5]選取家兔予環(huán)磷酰胺連續(xù)注射一段時間后，卵巢切片HE染色發(fā)現，使用環(huán)磷酰胺后原始卵泡和初級卵泡的異常率升高，卵泡中的顆粒細胞凋亡率增高，且雌激素的水平呈現出逐漸下降的趨勢。并得出結論以 50mg/kg 劑量連續(xù)注射2天是建立環(huán)磷酰胺誘導家兔卵巢早衰模型的最佳造模方式。

近些年，人們又逐漸發(fā)現了雷公藤的生殖毒性，長時間服用的女性出現卵巢功能下降甚至衰竭，具體表現為雌激素的分泌降低，導致FSH和LH的升高，女性出現月經量少甚至閉經[6]。受此啟發(fā)，有研究者提出采用雷公藤多苷片制備圍絕經期動物模型。何國珍等[7]選擇SD大鼠，予雷公藤多苷片溶液40 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃10周后發(fā)現，雷公藤大鼠模型組的生長卵泡和黃體數減少，血清中雌激素和孕酮水平降低，卵巢指數降低，但卵泡刺激素的水平無明顯變化，認為雷公藤多苷片可以導致雌性大鼠的卵巢功能降低，用于建立卵巢功能低下的模型可行。目前，采用雷公藤多苷片建立卵巢功能衰退的模型在國內外都非常經典，造模簡單可行，但用藥時間的長短和使用劑量說法不一，不易把握，對于用藥后多長時間能達到圍絕經期及卵巢早衰的診斷標準尚無統(tǒng)一意見。如何標準化雷公藤多苷片造模使用的劑量和時間及各時間節(jié)點卵巢及內分泌出現的相應變化是下一步亟待解決的問題。

藥物損傷卵巢的造模方法簡單，并且卵巢切片示各級卵泡不同程度地減少，動情周期表現為不同形式的紊亂，與圍絕經期的卵巢組織學和內分泌表現類似，但這些實驗研究均未長時間連續(xù)監(jiān)測大鼠的激素水平和動情周情的變化，所以停止用藥后是否大鼠持續(xù)卵巢功能衰退的狀態(tài)以及持續(xù)的時間，卵巢開始恢復排卵的時間不得而知。

三、射線損傷卵巢的動物模型

1.X線照射破壞卵巢動物模型：卵巢是女性生殖系統(tǒng)中對放射治療最敏感的器官，所以經過X線放射治療后卵巢較全身其他器官損傷更為嚴重。X線主要作用于細胞核，可引起DNA雙鏈或單鏈的斷裂，從而抑制DNA的合成和復制，阻止細胞的有絲分裂。X線對細胞有絲分裂的不同階段都有殺傷作用，但處于有絲分裂 G2期和M期的細胞對放射尤其敏感。而卵巢中的生殖細胞恰巧多處于第一次減數分裂前期和第二次減數分裂中期，相當于有絲分裂的M期[8]。所以X線照射會直接影響卵巢生殖細胞的有絲分裂，從而破壞卵巢功能。同時X線也會增加卵巢內氧化應激水平，促進細胞凋亡[9]。

賀宇恒等[10]采用放射治療的方式加速卵巢功能衰竭，選取8周齡C57BL6雌性小鼠，單次全身照射一定劑量的X線，7天后發(fā)現小鼠的雙側卵巢濕重下降，并且血清卵泡刺激素的水平顯著升高，卵巢切片原始卵泡和生長卵泡計數均顯著下降。追蹤監(jiān)測放療后14天、21天、28天和42天的相關指標，發(fā)現隨著時間的延長，小鼠的卵巢濕重逐漸下降，血清FSH水平逐漸升高，血清 E2水平則逐漸降低；卵巢內原始卵泡數和生長卵泡數逐漸減少至完全耗盡，至42天時卵巢內僅見閉鎖卵泡。

2.鈷60γ射線破壞卵巢動物模型：孫萍等[11]對于造模大鼠予鈷60γ射線照射，結果發(fā)現鈷60γ射線會加快大鼠卵巢功能衰退的進程，能直接阻礙卵泡的正常發(fā)育，損傷大鼠的生殖功能。此種方法造模可靠，且成功率比較高。但如同X線照射，對實驗室設備要求較高，一般實驗室人員不易掌握劑量及暴露時間，且對實驗人員的健康有潛在的威脅，臨床主要用于研究惡性腫瘤放射治療對組織器官的影響。

射線損傷卵巢的造模方法操作簡便，耗時短，成功率高且動物病死率低，為圍絕經期疾病的基礎研究提供了穩(wěn)定可靠的動物模型來源，但是對實驗室的設備和條件要求高，并且X線照射的時間及劑量需要摸索不易掌握，同時X線照射對實驗人員有一定的傷害，所以限制了此方法在臨床上的應用。

四、加速卵巢衰竭模型

目前，國內外常用VCD作為加速卵巢衰竭模型(AOF模型)制備的造模藥[12]。AOF模型包括了圍絕經期和絕經后模型，筆者主要研究的是圍絕經期的動物模型[13]。VCD為4-乙烯基環(huán)己烯(VCH)的代謝物(VCD)，VCH是輪胎生產硫化過程中產生的1,3-丁二烯的二聚體。VCD目前常被用作雙環(huán)氧化合物和環(huán)氧樹脂的有效中間體和反應稀釋劑?；ぴ?-乙烯基環(huán)工烯(VCD)可選擇性作用于動物原始及初級卵泡，能加速卵母細胞的閉鎖率，從而促進卵母細胞的凋亡[14]。Dinh等[15]聯合使用VCD 和鄰苯二甲酸鹽，結果發(fā)現，聯合用藥組血清AMH水平明顯降低。此外，聯合用藥組血清促卵泡激素水平顯著升高。

VCD制備的圍絕經期模型更接近于人類的圍絕經期。此模型維持了卵巢組織的存在，這點符合人類圍絕經期存在卵巢這一事實。同時VCD模型大鼠的內分泌變化也符合人類的圍絕經期表現。因為VCD是逐漸耗竭了小鼠或大鼠的原始卵泡和初級卵泡，而對次級卵泡和竇卵泡無影響，由于可供募集的卵泡減少，最終導致血清 E2水平下降，LH和FSH水平的升高，與生理性卵巢功能衰退的表現類似。體現出了卵巢功能逐漸下降的過程，能夠反應出圍絕經期動情周期的不規(guī)則性和波動性，尤其是雌激素水平的波動性，成功復制了人類的圍絕經期，是目前制備圍絕經期大鼠的理想模型。同時，VCD在低劑量給藥時，在引起原始卵泡凋亡的同時不影響其他周圍組織，如肝臟和脾臟，也不穿過血-腦脊液屏障，安全性較高。目前國外已將AOF模型用于實驗研究更年期心血管疾病、糖尿病、骨質疏松、腫瘤等。

五、自然衰老動物模型

在人類的絕經期，雌激素水平非常低或不可檢測，孕酮水平下降，促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)水平升高。自然狀態(tài)下中年大鼠從9～12個月齡開始表現出不規(guī)則的動情周期，通常以動情周期的延長為特征，將此階段定義為圍絕經期，此階段的大鼠可作為圍絕經期模型，用于圍絕經期的病因、機制及治療的相關研究。自然衰老的模型與人類圍絕經期生物學特征相似，子宮、卵巢、胸腺等器官的重量和形態(tài)上的改變以及性激素、神經遞質、自由基等的改變與人類圍絕經期的擬合度較高，而且能避免去卵巢或射線照射等原因造成的動物意外死亡，是研究圍絕經期的典型動物模型，使用比較廣泛，但造模周期長，費用較高，時間和人力成本高，因此限制了此類模型的應用。

六、免疫模型

免疫模型主要利用免疫反應破壞動物卵巢組織。王佩娟等[16]將A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠進行雜交繁殖B6AF1小鼠，篩選出B6AF1雌性小鼠，然后利用透明帶ZP3多肽免疫B6AF1雌性小鼠14天，發(fā)現小鼠動情周期紊亂，卵巢組織有炎性細胞浸潤，卵巢中有明顯透明帶出現，血清中性激素E2含量下降，并且FSH含量上升，利用透明帶多肽ZP3免疫B6AF1雌性小鼠能夠成功建立自身免疫性卵巢早衰模型，該模型發(fā)生率高，方法簡單，但臨床上主要用于免疫性因素導致的卵巢早衰的研究，應用于圍絕經期卵巢功能下降的研究則較少見。

七、制動應激致大鼠卵巢功能衰退

申可佳等[17]采用慢性制動應激的方法建立卵巢早衰及卵巢低反應小鼠模型，自制制動器限制小鼠的活動，連續(xù)14天將小鼠放入制動器內制動，制動時間從3h開始，逐漸延長至每天6h，造成小鼠慢性應激狀態(tài)，制動期間發(fā)現小鼠的進食、毛色等一般情況變差，體重明顯減輕(P<0.05)，動情周期異常的例數明顯增多(P<0.05)，結果提示慢性制動應激可以引起小鼠卵巢功能紊亂或減退。該模型相比去勢模型，操作較繁瑣，制備時間長，成功率不高，且有悖倫理，因此限制了該模型的臨床應用。

目前，用于制備圍絕經期綜合征動物模型的實驗動物除了大(小)鼠，還有雌性綿羊、兔、狗及靈長類動物等。但筆者常采用的是雌性大鼠、小鼠制備圍絕經期模型。因為靈長類動物成本高、難得到，限制了其應用。綿羊、狗因為體積大或價格較高而應用受限，家兔手術時死亡較多，操作不易。但是，如果不考慮成本等因素，我們應該去尋求和使用靈長類動物作為更好的模型，因為靈長類動物與人的生理過程更相似。

苗明三等[18]將圍絕經期動物模型分為病因模型，病理模型和病證結合模型，病因模型即本文所述的自然衰老模型，病理模型即去勢法制備的模型，包括完全去勢法和部分去勢法。對于病理模型，該研究僅提到了去勢法和乙醇損傷卵巢的方法，結合本文的分析，還應包抗腫瘤藥物損傷卵巢，及VCD等其他藥物損傷卵巢的方法。文中的病證結合模型主要用于中醫(yī)藥治療圍絕藥期綜合征的研究，模型制備基于的是中醫(yī)的理論基礎，應用范圍受到一定限制。

對于圍絕經期動物模型的制備，筆者認為關鍵的難點不在于制備方法，制備方法的選擇有多種，難點在于判定的療效指標，因為圍絕經期女性的卵巢功能并非完全喪失，血清激素的水平波動很大，動物之間的個體差異也很大。苗明三等對模型的判斷指標包括生化指標、表觀指標和病理學指標。其中生化指標是最重要的指標，核心指標為雌二醇(E2)和血清卵泡生成激素(FSH)、LH、T等，生化指標權重系數為0.4。表觀的核心指標為毛發(fā)光澤度、毛發(fā)脫落情況，精神狀態(tài)和飲食量，權重系數為0.3。病理學指標中最重要的是卵巢和子宮，權重系數也為0.3，最終計算出的總積分>0.6，則可認為該模型制備成功。筆者認為這3種指標中的表觀指標有待商榷，因為表觀指標的判定沒有量化標準，受人為主觀因素影響非常大，苗明三起草的表觀指標中尤其是毛發(fā)脫落情況和精神狀態(tài)的判斷，不容易標準化[22]。筆者認為對于模型造模成功的最主要判斷方法應該是生化指標和卵巢的病理指標。生化指標中最重要的是E2和FSH的波動水平，并且不能是單一的一次采血結果，應該至少連續(xù)3次在同一動情周期采血。目前，造模后取材和采血的時間點的確定是個很大的難點。因為對于嚙齒類動物來說，不同的時間點動情周期不一致，在不同的動情周期中，生化指標和卵巢切片的結果不一定一致，所以應該根據每只大鼠的動情周期確定采血時間，反復采血監(jiān)測生化指標的波動情況，但連續(xù)采血對動物本身傷害大，常用的眼眶采血對操作者的技術水平要求高，容易造成大鼠失明，對于實驗結果也會有一定的干擾?？傊磸筒裳拈g隔時間及造模后怎樣規(guī)定采血時間仍需要我們進一步探索，畢竟，圍絕經期的激素水平并非是直接跌入谷底，而是在正常值的基礎上出現較大幅度的波動，直到真正絕經后才維持在持續(xù)的低水平。而對于病理指標，應以卵巢為主，因為圍絕經期的本質就是卵巢功能的逐漸衰退，子宮內膜的變化是受卵巢分泌激素的影響。同時，造模的參考標準不應該是去勢模型，而是自然衰老的動物模型，因為去勢模型與自然的圍絕經期存在卵巢這一事實完全不符。所以，應先探索出自然衰老模型的動情周期變化，總結出規(guī)律后，再去判斷其他模型是否成功。

綜上所述，目前比較理想的制備圍絕經期大鼠的模型是VCD制備的模型和雷公藤損傷卵巢的模型，它們操作簡便，給藥方便，耗時短，花費相對較低，并且模型原理與人類圍絕經期的生理變化類似，擬合度更高。實驗人員在具體的研究中應根據實驗條件和目的選擇合適的動物模型。同時期望日后有更符合人類圍絕經期自然生理過程且操作方便的動物模型，也希望有更多大樣本圍絕經期模型的療效指標數據，以便于造模后的療效判定指標也能夠標準化，從而為女性圍絕經期及卵巢功能下降的研究奠定更堅實的基礎。