血漿SEPT9基因甲基化對結(jié)直腸癌診斷價值的研究進(jìn)展

血漿SEPT9基因甲基化對結(jié)直腸癌診斷價值的研究進(jìn)展

莊璐1,2李兆申1,2*

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科1(200433)第二軍醫(yī)大學(xué)臨床流行病學(xué)與循證醫(yī)學(xué)中心2

Early Diagnosis

2014年最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)位居惡性腫瘤的第三位，每年約有60萬人死于CRC；在美國，CRC也是腫瘤導(dǎo)致死亡的第三大病因，預(yù)計2014年將有136 830例新發(fā)病例，估計其中超過50 000例會因CRC死亡[1]。CRC同樣是中國的三大癌癥之一，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。目前已證實，早期篩查和診斷CRC可有效提高患者生存率并改善預(yù)后。Ⅰ/Ⅱ期CRC患者若加以合理治療、干預(yù)，5年生存率可達(dá)到90%以上。不幸的是，約80%的CRC患者在就診時即為中晚期，早期診斷率僅為11.8%。因此，CRC的早期篩查、早期診斷對于疾病的轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。

CRC篩查指南推薦50歲以上平均風(fēng)險人群接受以糞便隱血試驗[FOBT，包括愈創(chuàng)木脂F(xiàn)OBT(gFOBT)、糞便免疫化學(xué)檢測(FIT)]和結(jié)腸鏡檢查(金標(biāo)準(zhǔn))為主的篩查方法進(jìn)行定期普查[2]。然而，數(shù)據(jù)顯示，在美國至少有1/3的受檢者因糞便樣本采集不便、對有創(chuàng)性結(jié)腸鏡檢查的恐懼等原因而規(guī)避常規(guī)CRC篩查，致使每年約有44 000例患者因漏診CRC而死亡[3]。國內(nèi)也存在同樣的問題，2012年上海市疾控中心監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，僅有不到5%的受檢者做過FOBT，結(jié)腸鏡檢查的參與率則更低，僅為3%[4]。此外，在結(jié)直腸非創(chuàng)傷性檢查中，目前使用最廣泛、并已有大規(guī)模隨機對照試驗支持的gFOBT檢出CRC的敏感性僅為35%~64%，F(xiàn)IT檢測的敏感性和特異性相對較高，分別為65%~81%和87%~97%[5]。但這兩種FOBT檢測方法檢出無出血性CRC效果較差。不僅如此，由于取樣不便和可能需要重復(fù)檢測，gFOBT和FIT的患者依從性均較差。因此，尋找以血液為基礎(chǔ)的CRC特異性分子標(biāo)記物對提高受檢者篩查依從性具有重要意義?，F(xiàn)行的CRC血液學(xué)檢查主要包括血清CEA、CA19-9、CA242、CA724、CA125、血漿SEPT9基因甲基化、全血mRNA結(jié)直腸警哨檢測(ColonSentry)等。CEA等糖蛋白類腫瘤標(biāo)記物診斷CRC的敏感性和特異性均較低(18.8%~52.2%)，對CRC早期篩查和診斷的參考意義有限，而mRNA標(biāo)記物含量變化大，影響因素多，且提取過程中易降解，很難成為大規(guī)模使用的商業(yè)化檢測方法。新型血漿SEPT9甲基化檢測方法應(yīng)運而生，成為目前國外較為流行的外周血CRC早期檢測方法。Taber等[6]對100名不同種族接受CRC篩查者的調(diào)查結(jié)果顯示，與結(jié)腸鏡檢查、乙狀結(jié)腸鏡檢查和FIT相比，91%的受檢者傾向于接受血漿SEPT9甲基化檢測，因為該項檢測無需腸道準(zhǔn)備、禁食，也不受所服用藥物的影響，血液標(biāo)本采集方便，故受檢者依從性較好。SEPT9甲基化檢測對CRC早期篩查和診斷的優(yōu)勢較為明顯，本文綜述SEPT9甲基化檢測篩查和早期診斷CRC的現(xiàn)狀和研究進(jìn)展。

CRC的發(fā)生、發(fā)展通常伴隨許多表觀遺傳學(xué)改變，其中包括某些基因啟動子區(qū)域DNA的長期高甲基化[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，外周血細(xì)胞游離DNA(circulating cell-free DNA, ccfDNA)中有很多甲基化分子標(biāo)記物，其中與CRC相關(guān)并得到最深入研究的是SEPT9基因甲基化。SEPT9基因位于染色體17q25.3，起抑癌作用，其V2轉(zhuǎn)錄本啟動子gamma1區(qū)域的甲基化已被證實與CRC的發(fā)生密切相關(guān)，甲基化導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，從而影響基因的正常表達(dá)，并使其抑癌功能喪失，影響囊泡運輸、絲狀結(jié)構(gòu)形成、細(xì)胞分裂和凋亡等功能。這是由于SEPT9基因相應(yīng)表達(dá)SEPT9蛋白，SEPT9蛋白在細(xì)胞分裂過程中提供結(jié)構(gòu)支持，特別是在細(xì)胞分裂末段起重要作用。SEPT9蛋白是septin八聚體中處于兩末段的蛋白，如果表達(dá)異常，將嚴(yán)重影響胞質(zhì)分裂。大量臨床研究證實，不同于正常結(jié)直腸組織，CRC組織中可檢出明顯異常的SEPT9基因甲基化，SEPT9基因甲基化是CRC早期發(fā)生、發(fā)展過程中的特異性分子標(biāo)記物，因甲基化后的SEPT9基因可被癌組織釋放入外周血，故可通過早期檢測血漿中的SEPT9 V2轉(zhuǎn)錄本啟動子gammal區(qū)域的甲基化程度實現(xiàn)CRC的篩查[9]。Grutzmann等[10]的研究顯示，乳腺癌、卵巢癌、血液系統(tǒng)惡性腫瘤等腫瘤中的SEPT9基因異常甲基化檢出率遠(yuǎn)低于CRC，CRC患者、其他癌癥患者、正常人血漿SEPT9甲基化檢出率分別為72.0%(90/125)、11.5%(11/96)和10.4%(19/183)，可能與現(xiàn)行血漿SEPT9甲基化試劑盒檢測的主要靶片段為SEPT9_v2區(qū)域，而某些乳腺腫瘤的惡性表型與SEPT9_v1區(qū)域的高表達(dá)有關(guān)，SEPT9_v1和v4區(qū)域的mRNA水平改變在一定程度上反映了交界性卵巢腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[11]。此外，國內(nèi)有部分小樣本研究[12-13]觀察到胃癌組織中也有SEPT9基因甲基化異常改變，但研究結(jié)果暫無相關(guān)基礎(chǔ)研究的理論依據(jù)支持，利用SEPT9甲基化篩查胃癌的有效性還需進(jìn)一步研究證實。

第一代血漿SEPT9甲基化檢測試劑盒(Epi proColon)已于3年前開始在部分西方國家應(yīng)用，目前有涉及5 000多人次的多個獨立臨床研究評價了血漿SEPT9 DNA甲基化檢測對CRC的診斷價值。其中，比較CRC患者與健康對照者的回顧性研究結(jié)果參差不齊，早期研究結(jié)果顯示，血漿SEPT9 DNA甲基化檢測對CRC的敏感性只有50.9%~72.2%，特異性波動于85.8%~98.7%[10,14-18]。最近，Church等[19]的大型前瞻性研究顯示，第一代SEPT9 DNA甲基化檢測試劑盒檢出Ⅰ~Ⅳ期CRC的敏感性分別為35%、63%、46%和77.4%，特異性為91.4%(表1)。

第二代血漿SEPT9甲基化檢測試劑盒(Epi proColon 2.0)在DNA提取和PCR重復(fù)實驗技術(shù)方面較第一代有所提高，檢測敏感性穩(wěn)定提升。Toth等[20]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，第二代血漿SEPT9甲基化檢測試劑盒檢出CRC的敏感性波動于79.3%(2/3算法)~95.6%(1/3算法)，特異性為84.8%(1/3算法)~99%(2/3算法)，算法的選擇基于診斷或篩查的特定要求，1/3算法保證了檢測方法的高敏感性，但會相應(yīng)出現(xiàn)一定程度的低特異性(假陽性率高)，而2/3算法在確保較高特異性(真陰性率高)的同時敏感性相對較低[21]。該研究同期比較了CEA等檢測方法，結(jié)果提示SEPT9甲基化檢測對CRC具有高敏感性和高特異性，對于結(jié)腸鏡診斷有難度的右半結(jié)腸CRC，檢出率優(yōu)于gFOBT和CEA(表2)。Church等[19]的研究顯示，第二代血漿SEPT9甲基化檢測試劑盒檢出CRC的敏感性為63.9%。而Potter等[22]的最新前瞻性研究結(jié)果表明，血漿SEPT9甲基化檢測對CRC的敏感性為68%。最近Jin等[23]首次對476名中國受檢者以第二代血漿SEPT9甲基化試劑盒進(jìn)行檢測，檢出CRC的敏感性和特異性分別為74.8%和87.4%(表3)，而同期FIT檢出CRC的敏感性和特異性相對較低，分別為58%和82.4%，與既往研究結(jié)果相符[19-20,24]。不同于gFOBT的是，SEPT9甲基化檢測對不同年齡、性別、位于左半結(jié)腸/右半結(jié)腸的CRC診斷價值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Johnson等[27]的研究指出，SEPT9甲基化檢測檢出CRC的敏感性略高于FIT(73.3%對68.0%)，但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。目前，國內(nèi)已有BioChain公司授權(quán)代理第二代SEPT9基因甲基化CRC檢測試劑盒(Epi proColon 2.0)，并實現(xiàn)了國產(chǎn)化，降低了成本，4批產(chǎn)品已通過CFDA注冊檢驗，初步臨床試驗結(jié)果顯示檢出CRC的總體特異性高達(dá)87.4%，敏感性為74.8%[23]，而同期使用FIT檢出CRC的總體特異性和敏感性分別為82.4%和58.0%，展現(xiàn)了血漿SEPT9甲基化檢測篩查CRC有著很好的應(yīng)用前景。

表1　 第一代血漿SEPT9基因甲基化檢測試劑盒檢出CRC結(jié)果

PCR算法：2/3算法為3次PCR重復(fù)實驗中出現(xiàn)≥2次陽性，判斷樣品為陽性；1/3算法為3次PCR重復(fù)實驗中出現(xiàn)1次陽性，判斷樣品為陽性

表2　不同CRC檢測方法比較

IVD：體外診斷產(chǎn)品；LDT：實驗室成熟的檢測方法；CE：歐洲統(tǒng)一安全認(rèn)證；FDA：美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證；CFDA：中國食品藥物監(jiān)督管理局認(rèn)證

表3　第二代血漿SEPT9基因甲基化檢測試劑盒檢出CRC結(jié)果

目前諸多文獻(xiàn)支持腺瘤樣息肉-癌的CRC演變途徑，故是否能有效檢出結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤是CRC早期篩查的關(guān)鍵。兩項早期病例對照研究[10,18]顯示，SEPT9甲基化檢測檢出結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤的敏感性僅為16.7%(3/18)和17.6%(3/17)。Church等[19]的研究采用第一代SEPT9甲基化檢測試劑盒，檢出結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤的敏感性也較低(11.2%)，而Jin等[23]采用第二代SEPT9甲基化檢測試劑盒，檢出腺瘤的敏感性提高至27.4%，與同期進(jìn)行的FIT檢出結(jié)果類似。盡管SEPT9基因甲基化在結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤組織中也廣泛存在[17]，以該法檢測結(jié)直腸腺瘤的檢出率仍較低，可能與腺瘤組織內(nèi)的甲基化SEPT9基因釋放入血的時間和量與CRC組織不一致，以及晚期CRC才導(dǎo)致血管侵襲等因素有關(guān)。此外，該研究還進(jìn)一步指出，血漿SEPT9甲基化檢測的陽性率在CRC發(fā)展過程(即低度異型增生、高度異型增生、CRCⅠ~Ⅳ期)中呈逐漸升高趨勢。

綜上所述，已有諸多基礎(chǔ)實驗和臨床試驗數(shù)據(jù)支持血漿SEPT9基因甲基化檢測在CRC篩查和診斷中的作用。該法屬新型無創(chuàng)傷性檢測，并具有采樣安全方便、相對其他非創(chuàng)傷性檢查敏感性和特異性高、左右半結(jié)腸無差異、受檢者依從性好等特點，有望作為CRC有效的早期篩查工具，填補我國早期診斷CRC的特異性血液分子標(biāo)記物的空白。血漿SEPT9基因甲基化檢測與結(jié)腸鏡檢查相輔相成，可提高受檢人群的CRC檢出率，進(jìn)而降低CRC相關(guān)發(fā)病率和死亡率，但其在檢出CRC的總體敏感性、檢出CRC癌前病變(進(jìn)展期腺瘤等)的敏感性方面表現(xiàn)稍差，確切診斷價值尚有待更多大型隨機對照試驗驗證。

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(2014-12-31收稿；2015-05-04修回)

*本文通信作者，Email: zhaoshenli@hotmail.com

背景：早期篩查和診斷可有效降低結(jié)直腸癌(CRC)相關(guān)死亡率，并可提高患者總體生存率。目前的CRC早期篩查方法主要包括糞便隱血試驗和結(jié)腸鏡檢查。糞便隱血試驗敏感性低，假陽性較多，而金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)腸鏡檢查為有創(chuàng)性檢查，患者依從性較低。因此，目前臨床亟需尋找有效且簡便的CRC早期篩查和診斷方法。血漿SEPT9基因甲基化檢測是近年來國外已開始應(yīng)用的新型非創(chuàng)傷性CRC早期篩查和診斷方法之一，此法較為準(zhǔn)確、簡便，適合大規(guī)模篩查和早期診斷。本文就血漿SEPT9基因甲基化檢測對CRC的診斷價值以及相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

關(guān)鍵詞結(jié)直腸腫瘤；癌基因；DNA甲基化；腫瘤標(biāo)記，生物學(xué)；早期診斷

Progress in Study on Diagnostic Value of Plasma SEPT9 Gene Methylation for Colorectal CancerZHUANGLu1,2,LIZhaoshen1,2.1DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai(200433);2CenterforClinicalEpidemiologyandEvidence-BasedMedicine,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai

Correspondence to: LI Zhaoshen, Email: zhaoshenli@hotmail.com

AbstractScreening and diagnosis of early colorectal cancer (CRC) can reduce CRC mortality and improve overall survival. Currently, the major screening methods for early CRC include fecal occult blood test (FOBT) and colonoscopy. FOBT exhibits low sensitivity with high false positive rate, while the gold standard -- colonoscopy is invasive and with low compliance. Therefore, a convenient and effective screening and diagnostic method for early CRC is urgently needed. Plasma SEPT9 gene methylation assay is a new non-invasive screening and diagnostic method for early CRC used clinically in recent years, it exhibits high accuracy, and is convenient for mass screening and diagnosis of early CRC. This article reviewed the research progress and diagnostic value of plasma SEPT9 gene methylation assay for CRC.

Key wordsColorectal Neoplasms;Oncogenes;DNA Methylation;Tumor Markers, Biological;

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.09.011