木犀草素抗炎機(jī)制的研究進(jìn)展

于倩，巫冠中

(中國藥科大學(xué)藥理教研室，江蘇 南京 210009)

木犀草素是存在于許多藥用植物中的黃酮化合物，是植物中最豐富的次級代謝產(chǎn)物之一，并且具有各種藥理活性。木犀草素(3,4,5,7-四羥基黃酮)作為一種天然黃酮類物質(zhì)，存在于多種蔬菜，水果和藥用植物中，其中包括西蘭花、洋蔥葉、胡蘿卜、辣椒、卷心菜、蘋果皮和菊花等[1]。據(jù)報(bào)道，木犀草素具有抗氧化，抗微生物，抗炎，化學(xué)預(yù)防，化學(xué)治療，心臟保護(hù)，抗糖尿病，神經(jīng)保護(hù)和抗過敏的特性[2]。木犀草素的多種藥理活性被證實(shí)與其抗炎作用有關(guān)。同時(shí)，含有高木犀草素含量的中藥一直在伊朗和巴西用于治療炎癥相關(guān)的疾病[3]。

天然來源的化合物通常是先導(dǎo)化合物的一部分。事實(shí)上，目前有100多種天然產(chǎn)物的衍生藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)[4]。 黃酮類化合物，特別是來自多種具有傳統(tǒng)治療作用植物中木犀草素，其抗炎活性一直廣受關(guān)注。此外，由于木犀草素在微摩爾濃度下即顯示較強(qiáng)的抗炎活性[5]，因此它已成為一種潛在的抗炎化合物，可用于進(jìn)一步開發(fā)。一些研究報(bào)道了木犀草素的構(gòu)效關(guān)系，以確認(rèn)其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制，但是其發(fā)揮抗炎作用的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明，本文將對木犀草素的抗炎機(jī)制予以綜述。

1 氧化應(yīng)激

在炎性環(huán)境下，氧化應(yīng)激和炎癥是相互依賴和相互關(guān)聯(lián)的共存關(guān)系。炎性細(xì)胞在炎癥部位釋放活性氧(ROS)，導(dǎo)致氧化損傷。同時(shí)，過多的ROS和氧化應(yīng)激產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)促炎反應(yīng)[6]。木犀草素作為一種天然類黃酮化合物，其結(jié)構(gòu)含有一定數(shù)目的酚羥基，使其具有較強(qiáng)的還原性，從而具有抗氧化特性。研究證實(shí)木犀草素可作為ROS清除劑，抑制ROS的產(chǎn)生并活化相關(guān)的抗氧化酶。同時(shí)，木犀草素可以通過減少一氧化氮合酶(iNOS)的合成，從而減少NO的生成[7]。Seelinger等[5]認(rèn)為木犀草素可以通過抑制iNOS的作用，iNOS的表達(dá)和一氧化氮(NO)的生成。

據(jù)報(bào)道，在腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導(dǎo)造成人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷后使用木犀草素處理，HUVECs中乳酸脫氫酶(LDH)合成減少，超氧化物歧化酶(SOD)活性增強(qiáng)和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)水平升高，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生(6)。在脂多糖(LPS)和叔丁基氫過氧化物(t-BHP)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中，木犀草素以濃度依賴性方式抑制ROS和NO的生成[8]。還有在來自在來自Sprague-Dawley(SD)大鼠的骨髓來源的巨噬細(xì)胞中，木犀草素以劑量依賴性方式抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，并縮短了TNF-α和IL-6 mRNA的半衰期[9]。

此外，一些研究人員對木犀草素和其他物質(zhì)的聯(lián)用進(jìn)行了研究。 木犀草素和橘皮素的聯(lián)用對LPS刺激的NO產(chǎn)生良好的抑制活性，并且兩者之間具有協(xié)同作用[10]。 對前列腺素E2(PGE2)，白介素(IL)-1β和IL-6的產(chǎn)生也觀察到這種協(xié)同抑制[10]。 橘皮素和木犀草素單獨(dú)使用時(shí)均會(huì)抑制iNOS和環(huán)加氧酶-2(COX-2)mRNA的表達(dá)水平，橘皮素和木犀草素的聯(lián)用后對這兩種酶mRNA的表達(dá)水平抑制更強(qiáng)[10]。與木犀草素和菊苣酸的聯(lián)用也可協(xié)同抑制RAW264.7細(xì)胞中的iNOS、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生[11]?？傊罅垦芯勘砻髂鞠菟乜梢酝ㄟ^減少活性氧和活性氮的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用。

2 細(xì)胞因子

在炎癥反應(yīng)期間，免疫細(xì)胞可以分泌多種類型的介質(zhì)，其中包括細(xì)胞因子(例如干擾素、白介素和腫瘤壞死因子)、趨化因子(例如單核細(xì)胞趨化蛋白1)、類十二烷酸(例如前列腺素和白三烯)等[12]。這些炎癥介質(zhì)可以消除侵入的外來病原體并啟動(dòng)免疫調(diào)節(jié)。但在慢性炎癥的發(fā)展過程中，長期高水平的促炎介質(zhì)可造成細(xì)胞和組織不同程度的損傷[13]。無論是急性炎癥還是慢性炎癥，細(xì)胞因子都在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[14]。在緩解炎癥的過程中，減少炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的生成并抑制其相關(guān)功能是極其重要的，抗炎藥物的主要作用之一便是能夠調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)。木犀草素的抗炎作用一部分是通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，并在多種體內(nèi)和體外模型中顯示其調(diào)節(jié)炎性因子和炎癥介質(zhì)的作用。木犀草素能夠抑制IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、TNF-α、干擾素(IFN)-β和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且能夠提高IL-10(一種抗炎細(xì)胞因子)的水平。此外，木犀草素還可以抑制能夠控制免疫細(xì)胞遷移和定位的趨化因子(如：CCL2、CXCL2、CXCL8和CXCL9)等[15]。

3 花生四烯酸代謝途徑

目前已知花生四烯酸至少有3條代謝通路，而木犀草素對其中環(huán)氧化酶和脂氧酶兩條通路均有不同程度的影響?；ㄉ南┧峥赏ㄟ^COX-1/2先形成不穩(wěn)定的環(huán)內(nèi)過氧化物(PGG2和PGH2),然后在多種酶的作用下生成兩類化合物：前列腺素類(如PGE2和PGD2)和血栓素類(如TXA2和TXB2)。在炎癥反應(yīng)中，PGE2可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化或增加相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)起到促炎作用，從而加劇炎癥反應(yīng)[16]。而PGD2作為一種促炎因子，可以促進(jìn)炎癥發(fā)生，并在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[17]。多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究表明，木犀草素可通過抑制COX-2的表達(dá)從而減少PGE2的生成。同時(shí)，木犀草素還可以減少肥大細(xì)胞釋放PGD2[18-19]。據(jù)報(bào)道，小鼠口服木犀草素(10和50 mg·kg-1)可有效抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的足腫脹，RT-PCR結(jié)果顯示木犀草素是COX-2 mRNA的選擇性抑制劑[20]。在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7的細(xì)胞內(nèi)，木犀草素可以顯著抑制COX-2的蛋白表達(dá)，且明顯降低PEG2的水平[21]。此外，花生四烯酸也可以由脂氧酶催化生成白三烯，白三烯作為一類具有高度活性的炎癥介質(zhì)，參與多種疾病進(jìn)程。而木犀草素可以抑制白細(xì)胞三烯(LTB4)的合成并減少肥大細(xì)胞釋放白三烯[22]。

4 NF-κB 信號通路

核因子-κB(NF-κB)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可以調(diào)節(jié)多種促炎因子基因的表達(dá)，其中包括細(xì)胞因子，趨化因子和黏附分子等。在靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與κB抑制蛋白(IκB)形成復(fù)合體并以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，IκB激酶復(fù)合體(IKK)活化后會(huì)將IκB磷酸化，使NF-κB從失活狀態(tài)活化并暴露核定位位點(diǎn)游離的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，通過與特異性κB 序列結(jié)合而誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)位[23]。NF-κB在炎癥中發(fā)揮極其的重要作用，而許多相關(guān)研究已證明木犀草素的一部分抗炎作用是通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。具體來說，木犀草素可以通過作用于多種信號分子，其中包括抑制AKT磷酸化，抑制IκB降解，抑制NF-κB亞基易位，以及改變HDAC和HAT的活性來影響NF-κB信號傳導(dǎo)途徑。

研究發(fā)現(xiàn)木犀草素通過減弱IκBα和p65的磷酸化來降低NF-κB的活性。在佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和A23187共同刺激的肥大細(xì)胞(HMC-1細(xì)胞)中，木犀草素可以抑制IκBα降解和p65 NF-κB的核轉(zhuǎn)位[18]。除此之外，在TNF-α刺激的HUVECs中，木犀草素以劑量依賴的方式降低IκBα的磷酸化，并且能夠阻斷部分NF-κB/p65的易位[24]。同時(shí)，木犀草素可以通過抑制蛋白激酶B(AKT)磷酸化從而降低炎癥介質(zhì)的表達(dá)。Li等[25]發(fā)現(xiàn)木犀草素以濃度依賴性方式降低LPS誘導(dǎo)的AKT磷酸化。另一報(bào)道指出，木犀草素可使磷酸化AKT的濃度依賴性降低，而非磷酸化AKT的水平未改變[26]。此外，木犀草素還可以通過改變組蛋白去乙?；?HDAC)和乙?；?HAT)的活性來抑制炎癥。研究報(bào)道當(dāng)THP-1處于高糖環(huán)境時(shí)，木犀草素通過提高HDAC的活性并降低HAT的活性來抑制NF-κB介導(dǎo)的染色質(zhì)乙?；?，從而減少細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[27]。

此外，木犀草素和菊苣酸的聯(lián)用明顯抑制了LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中p65和IκBα的磷酸化[11]。 對木犀草素衍生物的研究表明，木犀草素可以抑制p65和c-Jun的磷酸化，而木犀草素-7-O-葡萄糖苷僅抑制p65的磷酸化;在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中觀察到類似的核轉(zhuǎn)位(木犀草素可以抑制NF-κB和AP-1的活化，但木犀草素-7-O-葡萄糖苷僅抑制NF-κB活化[28]。 因此，木犀草素比木犀草素-7-O-葡糖苷更強(qiáng)烈地抑制NF-κB的活化[28]。 木犀草素或木犀草素與綠原酸聯(lián)用會(huì)顯著抑制IL-1β刺激的RSC-364細(xì)胞中p-IKKα/β和NF-κBp50水平[27]?？傊?，木犀草素通過抑制NF-κB的活化來調(diào)節(jié)NF-κB信號傳導(dǎo)途徑，從而抑制促炎基因表達(dá)。

5 MAPK和AP-1信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)屬于細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。據(jù)報(bào)道，在多種細(xì)胞模型中，木犀草素可以調(diào)節(jié)MAPK信號傳導(dǎo)途徑的多種靶標(biāo)。在SW982細(xì)胞中，觀察到木犀草素可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38激酶活化，這證明了木犀草素對MAPK傳導(dǎo)途徑有一定的影響[29]。同時(shí)，木犀草素也抑制了IL-1β引起的AP-1核轉(zhuǎn)位[29]。Kang等[18]報(bào)道在PMA和A23187刺激的HMC-1細(xì)胞中，木犀草素抗炎通過減少ERK和JNK的活化來抑制促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放。其中細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的增加可通過激活鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶來調(diào)節(jié)活化T細(xì)胞(NFATs)核因子的核轉(zhuǎn)位[22]。 隨著二?；视?DAG)的產(chǎn)生，Ca2+的積累可以調(diào)節(jié)蛋白激酶C(PKC)的活化，從而介導(dǎo)下游信號通路的激活，包括MAPK通路和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[22]。

但是在不同的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校鞠菟赜袝r(shí)顯示出不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例如，在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中，Lee等[23]發(fā)現(xiàn)木犀草素不抑制JNK或ERK的磷酸化，而且木犀草素對MAPK的活化沒有影響，但卻以時(shí)間和劑量依賴性方式降低了LPS誘導(dǎo)的AKT磷酸化。同時(shí)，另一研究也認(rèn)為用木犀草素處理RAW264.7細(xì)胞不會(huì)改變LPS誘導(dǎo)的MAPK信號傳導(dǎo)，但是卻依然可以觀察到JNK磷酸化降低和下游c-Jun信號傳導(dǎo)的減弱[30]。木犀草素降低了c-Jun和AKT的蛋白質(zhì)水平，但是對它們的基因水平?jīng)]有影響[30]。此外，木犀草素降低了c-Jun和AKT的半衰期，并且阻斷了熱休克蛋白90(HSP90)與AKT的結(jié)合。由此，他們認(rèn)為木犀草素是通過抑制高遷移率族蛋白1(HMGB1)的表達(dá)，并抑制c-Jun和AKT的作用來產(chǎn)生抗炎作用[30]。

6 JAK-STAT信號通路

木犀草素可以降低STAT的結(jié)合活性，STAT1的磷酸化水平，IRF-1(一種調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子)的基礎(chǔ)表達(dá)水平，并下調(diào)因?yàn)長PS/γ-干擾素(IFN-γ)刺激所引起的IRF-1表達(dá)水平的增加[31]。木犀草素對LPS/IFN-γ刺激所引起的JAK1、JAK2和Tyk2磷酸化沒有顯著影響，但是在BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到Src磷酸化的減弱[31]。此外，木犀草素處理BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)-3的表達(dá)上調(diào)，表明木犀草素也可以通過影響這種負(fù)調(diào)控因子來使STAT1失活[31]。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞因子刺激的HT-29細(xì)胞中，木犀草素可以降低全細(xì)胞裂解產(chǎn)物和細(xì)胞核裂解產(chǎn)物中STAT1(Tyr701)的磷酸化水平[25]。在RAW264.7細(xì)胞中，木犀草素顯著下調(diào)IFN-γ刺激所引起的COX-2，磷酸化STAT1(Y701)和磷酸化STAT3(Y705)表達(dá)的增加;但是STAT1和STAT3總體水平卻保持不變。因此，木犀草素的一部分體外抗炎作用是通過抑制STAT1和STAT3信號傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的[32]。

有研究表明，木犀草素對STAT1和STAT3的抑制具有濃度依賴性。在感染了偽狂犬病病毒(PRV)的RAW264.7細(xì)胞中，通過檢測相關(guān)炎癥基因(啟動(dòng)子中具有STAT結(jié)合序列)的表達(dá)，Liu等[26]發(fā)現(xiàn)木犀草素可以降低細(xì)胞中IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的分泌。他們認(rèn)為木犀草素減少PRV感染的RAW264.7細(xì)胞中促炎介質(zhì)NO，iNOS和COX-2的產(chǎn)生，部分是通過抑制STAT1/3依賴的NF-κB途徑實(shí)現(xiàn)的。木犀草素-7-O-葡萄糖苷對STAT3或SIRT的穩(wěn)態(tài)水平?jīng)]有影響。類似地，木犀草素-7-O-葡糖苷不影響由IL-22和IL-6處理誘導(dǎo)的STAT3磷酸化[33]。然而，有趣的是，木犀草素-7-O-葡萄糖苷似乎阻止IL-22易位至細(xì)胞核[33]，盡管它對STAT的去乙?；瘺]有影響[33]。此外，研究發(fā)現(xiàn)木犀草素或者木犀草素與綠原酸聯(lián)用均可下調(diào)p-STAT3的水平，而且JAK1和糖蛋白130(gp130)的水平也顯著下降[27]。

7 肥大細(xì)胞

肥大細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的一部分，與多種炎癥性疾病密切相關(guān)。肥大細(xì)胞發(fā)揮其生理病理功能是通過釋放一系列的促炎性介質(zhì)所產(chǎn)生的，這些介質(zhì)包括組胺，細(xì)胞因子，趨化因子和蛋白(包括肥大細(xì)胞特異性糜酶和類胰蛋白酶)顆粒[34]。這些炎性介質(zhì)可進(jìn)一步加劇反應(yīng)區(qū)域的炎癥進(jìn)程，因此抑制肥大細(xì)胞釋放相關(guān)炎性介質(zhì)可緩解某些炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。而木犀草素作為天然黃酮類物質(zhì)，具有潛在的抗炎抗氧化和抑制肥大細(xì)胞的作用。在HMC1(人肥大細(xì)胞)中，木犀草素以濃度依賴的方式降低TNF-α、IL-6、IL-8、GM-CSF、TNF-α和COX-2的基因水平和蛋白質(zhì)水平，并減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，從而抑制肥大細(xì)胞釋放顆粒物質(zhì)[18]。木犀草素也可以抑制大鼠腹膜肥大細(xì)胞釋放組胺等物質(zhì)[35]。研究發(fā)現(xiàn)，缺糖缺氧環(huán)境會(huì)促進(jìn)MC/9(小鼠肥大式細(xì)胞)脫顆粒，但木犀草素和棕櫚酰乙醇酰胺聯(lián)用可以明顯抑制MC/9脫顆粒的進(jìn)行[36]。

8 展望

科研工作者對木犀草素的抗炎活性已進(jìn)行了大量的研究，并已證明其在多種細(xì)胞和動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出顯著的抗炎活性。此外，Theoharides等[37]報(bào)道了有關(guān)木犀草素臨床試驗(yàn)的初步研究。他們制造了膳食類黃酮制劑，該制劑主要含有木犀草素(100 mg，來自洋甘菊，純度>95%)、槲皮素(70 mg，來自槐花，純度>95%)和槲皮素糖苷蘆丁(30 mg，來自槐花，純度>95%)，這些化合物配制成微球(脂質(zhì)體)混合在橄欖仁油中，油酸和含水量低(<0.1%)，這樣會(huì)有利于吸收。37名受試者是來自美國各地患有自閉癥譜系障礙(ASD)的兒童(29名男孩和8名女孩，年齡4～14歲)。兒童接受2粒/20 kg體重(每粒膠囊含有200 mg總黃酮)至少持續(xù)4周的試驗(yàn)[37]。這項(xiàng)初步研究顯示，約75%的兒童胃腸道和過敏癥狀顯著改善，50%的兒童注意力得到提升等[37]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)揭示了木犀草素作為抗炎藥用于治療人類疾病的潛在用途，因?yàn)槟X炎癥與神經(jīng)精神疾病(包括ASD)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。但是，迄今為止的臨床研究僅限于ASD的臨床評估，因此，其他炎癥相關(guān)病癥也必須進(jìn)行廣泛的研究，例如特應(yīng)性皮炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬和克羅恩病。

綜上所述，木犀草素可以通過多種途徑緩解炎癥反應(yīng)，其中包括減少活性氧和活性氮的生成，影響花生四烯酸的代謝和多種炎性信號通路(NF-κB 信號通路；MAPK和AP-1信號通路；JAK和STAT信號通路)抑制炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)等。但目前我們對木犀草素的研究還存在局限性，一方面其抗炎機(jī)制尚未完全闡明，另一方面其安全性亟待充分的毒理學(xué)評價(jià)。因此通過對木犀草素抗炎機(jī)制及其毒理學(xué)的進(jìn)一步研究，有助于為木犀草素成為抗炎新藥提供依據(jù)。