真菌毒素的脫毒進展

張雪潔，安娜，高藝璇，徐浩，郭一飛

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

霉菌的種類繁多，目前約已發(fā)現(xiàn)45 000種，其中約有200多種能產(chǎn)生毒霉菌，約有50種霉菌可引起人畜中毒。主要的霉菌毒素種類有黃曲霉毒素(AFs)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、T-2 毒素(T-2 toxin)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、赫曲霉毒素(OTA)、煙曲霉毒素(Fum)等。真菌毒素普遍存在于飼料、谷物、食品及中藥材中，其毒性根據(jù)毒素的劑量、暴露持續(xù)時間、所處的環(huán)境和處理因素而變化[1]。霉菌毒素攝入可能對人和動物引起各種慢性和急性效應(yīng)，例如肝毒性、遺傳毒性、免疫抑制、腎毒性、致畸或致癌作用。

美國、歐盟、日本、韓國、中國等地區(qū)對于上述真菌毒素的檢測在食品中已制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，而歐盟及美國等國家更是做出了嚴(yán)格的限量規(guī)定(見表1)。目前，我國對于食品及藥品中真菌毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)與國外基本相同，檢測方法也較為先進。2017年，國家頒布食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017，《食品中真菌毒素限量》規(guī)定了食品中黃曲霉毒素B1和M1、DON、展青霉素、OTA、ZEA等6種真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)外對于真菌毒素的安全性問題認識較早且較深刻，各種限量標(biāo)準(zhǔn)也建立的較完善，監(jiān)督和檢測方面均已建立成熟的體系。但由于中藥成分復(fù)雜，且真菌毒素種類眾多，不同毒素的危害性各不相同，為了用藥安全并減少不必要的損失，需要對于中藥材中真菌毒素定性定量檢測之后，進行真菌毒素的脫除[2]。

對于真菌毒素的脫除，現(xiàn)在常用的脫除方法按照作用機理大致可分為物理脫除、化學(xué)脫除及生物降解。物理脫除主要包括吸附、分選等；化學(xué)脫除則是利用化學(xué)反應(yīng)改變真菌毒素的結(jié)構(gòu)，降低其毒性，進而實現(xiàn)脫毒；生物降解是利用微生物或酶進行脫毒。

1 物理脫除

物理吸附是利用一些具有吸附性質(zhì)的材料如沸石等對毒素進行吸附。其機理是吸附劑與毒素在動物體內(nèi)結(jié)合形成復(fù)合體，使毒素在體內(nèi)經(jīng)過消化道時不被吸收而排出體外，減少機體、血液和靶器官中的毒素含量，從而減弱毒素的毒害[3]。

表1 中國、歐盟及美國對真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)(μg·kg-1)

注：“-”表示沒有明確限量要求

1.1 脫除材料 目前文獻報道的主要有以下幾種。

1.1.2 膨潤土 膨潤土是一種廉價的非營養(yǎng)性非選擇性多價螯合劑，對污染物具有很高的吸附能力，通常用作飼料添加劑，其機理是在胃腸道中吸附毒性降低生物利用度，從而降低黃曲霉毒素的毒性。可以有效預(yù)防黃曲霉毒素。近年來，研究人員不斷改進膨潤土的結(jié)構(gòu)以提高膨潤土的吸附能力，并且在這方面已有許多報道。Nones等[6]用兩種有機鹽-苯扎氯銨和十六烷基三甲基溴化銨處理膨潤土，使膨潤土的層間間隔增大，對AFB1的吸附能力顯著提高。此外，這兩種材料可能保護神經(jīng)嵴干細胞免受AFB1造成的損害。Nones等[7]是通過摻入鋅離子來改性巴西膨潤土，膨潤土的鋅處理增加了AFB1的吸附，從而降低黃曲霉毒素的毒性，且對成纖維細胞等正常細胞沒有毒性。

1.1.3 蒙脫石 蒙脫石是一種具有較高的離子交換容量及吸水膨脹能力的硅鋁酸鹽。將它應(yīng)用于吸附真菌毒素，取得了良好的效果。Wang等[8]通過實驗證明，精煉鈣蒙脫石粘土邊緣處的表面羥基層在基面上具有永久的負電荷，對AFB1和FB1有良好的吸附效果。Bekci等[9]發(fā)現(xiàn)蒙脫石K10和柱撐蒙脫石K10可吸附ZEA。

1.1.4 介孔分子篩 介孔分子篩SBA-15具有二位六方通孔結(jié)構(gòu)，其表面積大，在分離、催化劑納米組裝等方面具有很大的應(yīng)用價值。Appell等[10]研究了丙硫醇官能化的SBA-15對霉菌毒素污染的水溶液的吸附。丙基硫醇改性的SBA-15在低pH及加熱至60 ℃，可顯著降低受污染樣品中展青霉素的水平。

1.1.5 大孔樹脂 大孔樹脂是一種具有高分子的聚合物吸附劑，以吸附為特點，對有機物具有濃縮、分離作用。它主要是利用聚合基元、交聯(lián)劑、致孔劑、分散劑等經(jīng)聚合反應(yīng)制備而成。這類聚合物具有高孔隙率，利用孔穴吸附有機物，實現(xiàn)分離純化。崔麗麗等[11]合成新型大孔吸附樹脂 LKS-11，利用大孔吸附樹脂的選擇吸附性能等優(yōu)點，分析不同來源的人參提取物中農(nóng)藥腐霉利的脫除效果。LKS-11對人參、西洋參提取物中的腐霉利具有良好的吸附性能，腐霉利脫除率和產(chǎn)品回收率均在90% 以上。

1.1.6 纖維素 纖維素是一種大分子多糖，廣泛的分布于自然界中，由于其分子中具有豐富的羥基，可通過分子間氫鍵吸附真菌毒素。Zadeh等[12]通過酸水解合成納米纖維素，然后分別用不同的游離脂肪酸修飾，通過脂肪酸與FB1疏水尾部發(fā)生親酯相互作用，F(xiàn)B1的毒性大大降低。這些新型吸附劑可與不同食品一起用于去除FB1。

1.1.7 殼聚糖 殼聚糖是另外一種多糖，它是由自然界中幾丁質(zhì)經(jīng)脫乙酰作用得到的，由于其較強的吸附能力，被廣泛用于水處理、金屬提取及回收等領(lǐng)域。Liu等[13]以戊二醛為交聯(lián)劑，硫脲為改性劑，制備了硫脲改性殼聚糖樹脂(TMCR)，在不同pH值，溫度，接觸時間和棒曲霉素濃度下TMCR對棒曲霉素的吸附能力。結(jié)果顯示TMCR有效清除來自水溶液的棒曲霉素。

1.1.8 其他納米材料 隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，將現(xiàn)有的材料制成納米材料，增加材料的比表面積，從而增加其吸附能力，在真菌毒素的吸附脫除方面得到了應(yīng)用。Zhang等[14]使用表面活性劑硬脂基二甲基芐基氯化銨修飾埃洛石納米管(MHNT)，研究了MHNT從模擬胃液和模擬腸液中吸附ZEA的效率。結(jié)果表明，表面活性劑修飾的埃洛石納米管減輕了ZEA暴露的毒性和雌激素效應(yīng)，包括氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物和器官重量的變化，并且MHNT可以在動物飼料或胃腸道中與ZEA結(jié)合。Pirouz等[15]使用磁性氧化石墨烯納米復(fù)合材料作為吸附劑以減少天然污染的棕櫚仁餅中的鐮刀菌毒素，對DON，ZEA，HT-2和T-2的吸附分別達到69.57%、67.28%、57.40%和37.17%的水平。

1.2 分選 分選主要是根據(jù)物料色澤、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、比重等不同，通過改變儀器參數(shù)將染病物料從正常物料中分選出來，目前通過分選去除真菌毒素技術(shù)主要包括比重分選、色差分選等。崔航使用比重去石機分選小麥中赤霉病小麥籽粒，物料流速和風(fēng)速對赤霉病小麥籽粒分選效果影響顯著，赤霉病籽粒含量越高分選赤霉病小麥籽粒效果越好[16]。同時，崔航也使用色選機研究了色差分選對赤霉病小麥籽粒的分選效果，結(jié)果顯示色選機的精度對赤霉病小麥籽粒的分選效果影響顯著，流速對赤霉病小麥籽粒的分選效果影響不顯著，通過光電分選赤霉病小麥籽粒去除率高達50%。

1.3 小結(jié) 物理吸附的機理主要是利用吸附材料本身具有的特性，是利用分子內(nèi)部的吸力所引起的吸附，與毒素的結(jié)合相對較弱，吸附熱較小，吸附和解析速度也都較快。被吸附物質(zhì)也較容易解析出來，但吸附劑與被吸附物質(zhì)的性質(zhì)不發(fā)生變化，吸附劑可回收再利用，具有良好的環(huán)保性能。

2 化學(xué)脫毒

化學(xué)脫毒是利用某些技術(shù)或者化學(xué)物質(zhì)來實現(xiàn)真菌毒素的降解，從而起到減小或消除真菌毒素的危害[17]，在此過程中，真菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。按照脫毒機制的差異，大致可分為熱處理、輻射、電化學(xué)及化學(xué)添加劑脫毒。

2.1 熱處理 過熱蒸汽是對飽和蒸汽定壓加熱的產(chǎn)物，也是降解真菌毒素最常用的方法。相比于傳統(tǒng)的高溫處理方法，過熱蒸汽具有安全性高、無污染、熱效率高、傳熱速度快的優(yōu)點。根據(jù)熱處理的機制，溫度越高，真菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定，對真菌毒素的降解也越有利。但隨著溫度的升高，對機體的品質(zhì)也會產(chǎn)生一定的影響。劉遠曉等[18]調(diào)整蒸汽溫度、處理時間和蒸汽流速后，對DON的降解率有顯著提高，最高可達79.8%，最高可將DON含量為4.9 μg·g-1的赤霉病小麥中DON含量降至國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量范圍內(nèi)。雖然過熱蒸汽處理對DON有較好的降解效果，但由于現(xiàn)有設(shè)備的局限以及過熱蒸汽對小麥品質(zhì)可能產(chǎn)生的不利影響，該方法在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用仍需要進一步的探索和研究。

利用擠壓技術(shù)，通過摩擦、剪切、加熱對物料產(chǎn)生高溫、高壓、高剪切力作用，可有效降解真菌毒素。張鵬飛[19]利用擠壓技術(shù)，有效降解麩皮中DON，提高擠壓機機筒溫度、降低麩皮水分含量、降低主機頻率及喂料機頻率，將麩皮中DON降解率提高為86.13%±0.03%。鄭海燕[20]利用擠壓膨化技術(shù)降解糙米、玉米、花生粕中的AFB1，降解率為39.6%～77.6%。Zheng等[21]通過擠壓蒸煮降解花生粕中的AFB1，降解率為77.6%±2.2%。

2.2 輻射 輻射主要是利用微波或者射線對被污染物進行照射，利用射線的能量使真菌毒素發(fā)生降解，從而實現(xiàn)脫除。輻射分為離子輻射和非離子輻射。在離子輻射(如 X射線、γ射線、紫外線)中，被照的物體處于低溫或不發(fā)生顯著變化時，其分子結(jié)構(gòu)就可能會發(fā)生改變，這些分子結(jié)構(gòu)的改變對于暴露于離子輻射下的活有機體是非常有害的[22]。非離子輻射(如無線電、微波、紅外線、可見光等)達到一定強度使導(dǎo)致溫度升高后，通常會導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但這種變化是對人類無害的。Aziz等[23]通過實驗得出輻射對有害真菌的生長和毒素的產(chǎn)生都有明顯抑制，他們的實驗證明，與對照組相比，γ射線的劑量為4.0 kGy 時可大大減少霉菌(鐮孢霉，曲霉)的生長；在6.0 kGy 時對AFB1的降解率為74.3%～76.7%、OTA 51.3%～96.2%、ZEA達到78%。

微波殺菌技術(shù)因具有快速、高效、安全和環(huán)保，加熱時間短、升溫速率快、能耗少、微波輔助堿法降解條件溫和、操作簡單、降解效率高，更具有無化學(xué)物質(zhì)殘留，安全性較高等優(yōu)點。王勇等[24]用微波輔助堿法處理稻米粉中的AFB1，稻米粉中AFB1的降解率為98.5%，AFB1殘留量符合國家標(biāo)準(zhǔn)。林耀盛等[25]利用微波輔助酶法脫除米糠中黃曲霉毒素，結(jié)果顯示脫除率為92.4%。

2.3 電化學(xué) 電化學(xué)方法的特點是不使用有害化學(xué)試劑，綠色環(huán)保，不會造成二次污染，降解效率高，降解徹底等。孫艷[26]利用輝光放電等離子體技術(shù)能夠徹底降解蘋果汁中的棒曲霉素，降解效果顯著(P<0.05)，在5 min內(nèi)降解率達到96.6%。Fan等[27]通過調(diào)節(jié)電流和電壓，由電解水發(fā)生器產(chǎn)生具有不同pH值的堿性電解水(AlEW)，當(dāng)pH 12.2時，AlEW具有更大的去除AFB1的潛力(Fan S等，201)。

2.4 化學(xué)添加劑

2.4.1 氧化法 在氧化劑(次氯酸鈉、過氧化氫、二氧化氯等)的誘導(dǎo)作用下，真菌毒素被氧化，從而失去毒性。

臭氧具有較高的活性、滲透性，并自發(fā)分解為氧氣，不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，因此被廣泛用于研究農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的脫除。刁恩杰[28]利用干法和濕法處理臭氧均能有效降解花生中的AFB1。在相同條件下處理30 h時，干法處理可將花生中的AFB1脫除82.8%；濕法處理可將花生中的AFB1脫除89.7%。孫超[29]發(fā)現(xiàn)臭氧水降解DON毒素殘留效果顯著，短時間反應(yīng)(<10 min)降解率即可達83%。

二氧化氯(ClO2)作為被WHO、FDA 等組織公認安全、無毒的綠色消毒劑，具有氧化性強、殺菌能力好等特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于自來水消毒、空氣殺菌、水產(chǎn)和禽畜養(yǎng)殖及醫(yī)療等領(lǐng)域。常曉嬌等[30]研究了不同濃度的ClO2對AFB1、ZEA、DON和FB1的降解作用，結(jié)果表明，對AFB1、ZEA和FB1具有很好的降解效率，而對DON無降解效果。孫超[29]通過ClO2對禾谷鐮刀菌生長及產(chǎn)毒基因的抑制實驗，說明ClO2可有效預(yù)防收獲后糧食中禾谷鐮刀菌生長以及DON毒素的產(chǎn)生。

2.4.2 還原法 還原劑與真菌毒素結(jié)合改變真菌毒素的分子結(jié)構(gòu)及毒性。常見的還原劑包括亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉等。Young等[31]在80 ℃使用亞硫酸氫鈉溶液處理玉米18h后DON降解率達85%，DON分子轉(zhuǎn)化為DON-磺酸鹽。D?nicke等[32]使用含水量22%的飽和蒸汽處理添加焦亞硫酸鈉的面粉，處理時間15 min，面粉中DON降解率高達95%，在中性和酸性條件下DON性質(zhì)穩(wěn)定，在堿性條件下其結(jié)構(gòu)易被破壞。

2.4.3 加堿法 氨氣法有很多優(yōu)點，操作簡便，少殘留，又來源廣泛，氨與AFs結(jié)合后發(fā)生脫羥作用，致使AFs的內(nèi)酯環(huán)發(fā)生裂解失去活性或生成新的無毒小分子，從而達到去毒效果。不足之處，操作周期時間長，氨氣熏蒸后，影響被測物外觀及食用口感。梁俊平[33]在降解花生中AFB1，氨氣在濃度7%時，AFB1降解率為83.5%，降解花生粕中AFB1，氨氣在濃度10%時，AFB1降解率為100%。

在稀堿(如NaOH、氨水、氫氧化鈣等)等作用下，AFB1的內(nèi)酯環(huán)發(fā)生斷裂，形成香豆素鈉鹽或銨鹽，可以使其毒性消失。DON 分子中環(huán)氧基團被打開或者是C-15進行重排形成醛基或內(nèi)酯。龍杰[34]在浸漬過程中添加稀堿性物質(zhì)降低高粱麥芽中霉菌，抑制毒素產(chǎn)生。浸漬在稀濃度的NaOH中可減少麥芽中的微生物菌落數(shù)量，所有浸漬在0.2% NaOH溶液中的麥芽品種，其霉菌大約會降低3.5 cfu·g-1，同時，某些種類的霉菌數(shù)量也會大大下降，甚至檢測不到。

2.5 小結(jié) 化學(xué)脫毒雖然非常有效，真菌毒素脫除率很高，但其實施條件較為苛刻，對微量、難分離的毒素脫除效果并不明顯，而且這些方法尤其使用有機試劑時，會引入新的污染物，造成二次污染。

3 生物脫毒

生物脫毒是利用微生物在其生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或是微生物自身的特性抑制真菌霉素的生長，進而減少了真菌霉素的污染；或者利用生物間的黏附作用降解和去除真菌毒素。

3.1 發(fā)酵與降解 微生物的發(fā)酵產(chǎn)酶對毒素的降解主要是將霉菌毒素轉(zhuǎn)化為低毒或無毒的物質(zhì)，相對于其他方法，其優(yōu)點在于特異性強，而且避免了毒素的二次污染。酶法脫毒具有更好的重復(fù)性、均一性和操作簡單等特點，黃曲霉毒素的生物降解酶主要為氧化還原酶類，該酶主要作用于AFB1的二呋喃環(huán)，從而破壞黃曲霉毒素；對赫曲霉毒素，是針對分子內(nèi)的肽鍵進行降解得到小分子氨基酸；對玉米赤霉烯酮，水解內(nèi)酯環(huán)生成玉米赤霉烯醇。

Zhou等[35]利用最有效的降解菌株發(fā)酵系統(tǒng)的各種組分，并測定去除T-2的能力。表明乳酸乳球菌是去除T-2最有效的降解菌株。雷嬌[36]考察不同培養(yǎng)基成分和不同發(fā)酵條件對AFB1降解酶的影響。結(jié)果當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，AFB1降解率達87.5%，初始pH為7.0時AFB1降解率達89.3%，發(fā)酵時間與AFB1降解率呈正相關(guān)性，培養(yǎng)4 d時降解率達83.5%。

3.2 微生物吸附 微生物吸附是指其菌體細胞壁通過非共價鍵、官能團間的化學(xué)鍵、大分子之間的相互作用力、以及表面張力等與毒素分子結(jié)合，形成復(fù)合體系。 Taheur等[37]研究結(jié)果表明，當(dāng)在牛奶中培養(yǎng)時，顆粒的微生物聚生體吸附AFB1、ZEA和OTA的吸附率在82%～100%。

3.3 活體菌株 Armando等[38]研究釀酒酵母菌株的有益性質(zhì)和AFB1結(jié)合能力，因為它們能夠去除OTA和ZEA。釀酒酵母RC012和RC016顯示出最高的OTA去除效率，而RC009和RC012菌株顯示出最高的ZEA去除效率。所有測試的釀酒酵母菌株都能夠去除OTA和ZEA，并且物理吸附是去除OTA和ZEA的主要機制。植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8菌株吸附的主要位點是細胞壁的肽聚糖，吸附AFB1效率分別是82.6%和86.3%，具有作為生物介質(zhì)用于脫除環(huán)境中伏馬毒素的潛力[39]。

3.4 小結(jié) 相對于另外兩種降解技術(shù)，生物降解具有無二次污染的優(yōu)勢。其條件溫和，但成本比較高。目前大多將幾個方法相互結(jié)合使用，也是目前研究的主流方向，楊彥瓊[40]研究以硅鋁酸鹽化合物為基礎(chǔ)，配合酵母細胞提取物，以科學(xué)配比制成一種新型復(fù)合吸附劑，通過篩選酵母細胞提取物、膨潤土、改性膨潤土以及不同配比的復(fù)合物在相同條件下對AFB1的吸附效果，得到對AFB1吸附效果最佳的改性膨潤土與酵母細胞提取物復(fù)合物(比例7∶3)，吸附量為18.3 μg·g-1，吸附率為91.9%。

4 結(jié)語

物理吸附主要由材料的本身特性決定，分子間吸力，材料可回收再利用?；瘜W(xué)吸附改變毒素的分子結(jié)構(gòu)，降低毒性。生物吸附是抑制真菌毒素的生長，通過生物降解酶降解，微生物吸附，避免了二次污染。綜上所述，目前，對真菌毒素的脫除研究較多，各種方法均有一定的局限性，還應(yīng)尋找新的脫除材料，或相互結(jié)合使用，規(guī)避缺點。