米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦出血后VEGF、GLUT-1表達(dá)的影響

陳建新

摘要：目的 ?研究米諾環(huán)素對(duì)腦出血大鼠VEGF、GLUT-1表達(dá)的影響，探討其的腦保護(hù)作用機(jī)制。方法 ?選用雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及米諾環(huán)素組，每組20只。采用Ⅶ型膠原酶法制備Wistar大鼠右側(cè)紋狀體出血模型。模型制備成功后米諾環(huán)素組給予腹腔注射米諾環(huán)素，劑量為22.5 mg/kg，2次/d，假手術(shù)組和模型組給予腹腔注射等量的生理鹽水。觀察腦缺血后改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）、腦組織含水量，Western blots及免疫組化法分別檢測(cè)VEGF及GLUT-1的表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，米諾環(huán)素組大鼠腦組織的mNSS評(píng)分、腦組織含水量、VEGF及GLUT-1的表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?米諾環(huán)素可顯著減輕腦出血后大鼠的神經(jīng)功能損害及組織學(xué)損傷，并提高大鼠腦組織VEGF及GLUT-1的表達(dá)水平，對(duì)腦出血具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)VEGF及GLUT-1的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腦出血;米諾環(huán)素;VEGF;GLUT-1

中圖分類(lèi)號(hào)：R743.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.026

文章編號(hào)：1006-1959（2019）21-0085-03

Abstract：Objective ?To investigate the effects of minocycline （MC） on the expression of VEGF and GLUT-1 in rats with intracerebral hemorrhage， and to explore the mechanism of brain protection of minocycline. Methods ?60 male Wistar rats were randomly divided into sham operation group， model group and minocycline group， with 20 rats in each group. The right striatum hemorrhage model of Wistar rats was prepared by type VII collagenase method. After successful model preparation， the minocycline group was given intraperitoneal injection of minocycline at a dose of 22.5 mg/kg twice daily. The sham operation group and the model group were given an equal amount of normal saline. The cerebral ischemic modified neurological deficit score （mNSS）， brain tissue water content， Western blots and immunohistochemistry were used to detect the expression of VEGF and GLUT-1.Results ?Compared with the model group， the mNSS score， brain water content， VEGF and GLUT-1 expression in the brain tissue of the minocycline group were significantly lower （P<0.05）.Conclusion ?Minocycline can significantly reduce the neurological damage and histological damage in rats after intracerebral hemorrhage， and increase the expression of VEGF and GLUT-1 in rat brain tissue. It has a certain neuroprotective effect on intracerebral hemorrhage， and its mechanism may be associated with enhanced expression of VEGF and GLUT-1.

Key words：Intracerebral hemorrhage;Minocycline;VEGF;GLUT-1

腦出血（intracerebral hemorrhage，INH）是常見(jiàn)的卒中類(lèi)型，具有較高的致殘率及致死率，嚴(yán)重威脅患者生命健康及生活質(zhì)量，給社會(huì)及家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前仍缺乏有效的藥物改善預(yù)后，因此探討腦出血的病因并尋找針對(duì)性的有效藥物是亟待解決的問(wèn)題[1]。近年來(lái)亦有研究表明米諾環(huán)素（MC）對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是體內(nèi)一種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及神經(jīng)再生作用的因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，加速組織修復(fù)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）可維持機(jī)體的能量代謝，并參與機(jī)體的多種神經(jīng)生理過(guò)程，從而對(duì)腦組織發(fā)揮保護(hù)作用，而發(fā)揮主要作用的是GLUT-1[3]。本研究利用大鼠腦出血模型，檢測(cè)MC對(duì)腦出血大鼠腦組織VEGF及GLUT-1表達(dá)的影響，探討MC對(duì)腦出血的潛在神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和處理 ?健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，8周齡，體重約250～300 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組、模型組及米諾環(huán)素組，每組20只。

1.2方法

1.2.1腦出血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕??采用Ⅶ型膠原酶法制備Wistar大鼠腦出血模型。具體操作如下：以8周齡雄性Wistar大鼠前囟為原點(diǎn)，在大鼠前囟右側(cè)3.2 mm、前方0.5 mm處，以微型電鉆（Roboz，RS-6300，美國(guó)）鉆孔，將微量注射器固定于相應(yīng)位置緩緩插入，深度5.6 mm，米諾環(huán)素組和模型組大鼠以微量注射器（Hamilton，80565，美國(guó)）向其右側(cè)紋狀體緩慢注射經(jīng)無(wú)菌生理鹽水（廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H45020977，規(guī)格：500 ml/瓶）稀釋的Ⅶ型膠原酶（江萊生物<上海>，93703879）2 μl，假手術(shù)組大鼠注射等體積生理鹽水，停針3 min使溶液充分?jǐn)U散后拔針、仔細(xì)縫合手術(shù)傷口。術(shù)后米諾環(huán)素組予腹腔米諾環(huán)素注射液（湖北潛龍藥業(yè)股份公司，批號(hào)：20050602，規(guī)格：50mg）22.5 mg/kg，2次/d，假手術(shù)組和模型組給予腹腔注射等量生理鹽水，共28 d。

1.2.2神經(jīng)功能評(píng)價(jià) ?分別于治療后第1、3、7、14、28天使用改良mNSS評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能。包括運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)（6分）、感覺(jué)實(shí)驗(yàn)（2分）、平衡木實(shí)驗(yàn)（6分）、反射實(shí)驗(yàn)和不正常運(yùn)動(dòng)（4 分），總評(píng)分共18 分，其中評(píng)分7分以下為輕度損害、評(píng)分7～12分中度損害、評(píng)分12分以上重度損害。

1.2.3腦組織含水量測(cè)定 ?采用干濕重法測(cè)定腦組織含水量。治療結(jié)束后每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（第1、3、7、14、28天）分別隨機(jī)選取3只大鼠，以10% 水合氯醛（300 mg/kg）（Macklin， MFCD00044479，美國(guó)）麻醉大鼠，端頭取腦，稱(chēng)重缺血側(cè)的腦組織，后將其放入100 ℃的烤箱（中杰，ZJ885-6型，蘇州）中烤至恒重，當(dāng)2次稱(chēng)重腦組織質(zhì)量差小于0.2 mg時(shí)，記錄最后1次質(zhì)量為腦組織的干重。計(jì)算腦組織的含水量，腦組織含水量（%）=（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%。

1.2.4大鼠腦組織灌注取材 ?治療結(jié)束后，各組剩余5只大鼠予腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪刀剪開(kāi)劍突下皮膚，充分暴露心臟，以大號(hào)注射針頭刺入尖部，經(jīng)左心室入主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳。以生理鹽水約100 ml 快速灌注，繼之300 ml 生理鹽水緩慢灌注，于冰上斷頭取腦，額極后2.5 mm 處切取3.0 mm 厚的腦組織，每只大鼠的一半腦組織放入4%多聚甲醛液中浸泡30 min 后進(jìn)行聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（OCT）包埋，另一半腦組織經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存，提取蛋白后行Western blots檢測(cè)。

1.2.5 Western blots檢測(cè)VEGF表達(dá)水平 ?取凍存腦組織，加入組織蛋白質(zhì)抽提液，勻漿器高速勻漿，4℃冰凍離心機(jī)以12000 r/min離心15 min，收集上清液，采用BCA試劑盒（百奧萊博，HR-0359-BKL，北京）檢測(cè)總蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度配膠上樣，每孔20 μg 蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，以5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃下VEGF（BioXcell，BE0060-100MG）一抗孵育過(guò)夜，洗膜后二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法掃膜分析，以β-actin （TIANDZ，130590-20，中國(guó)）作為內(nèi)參。

1.2.6免疫熒光染色檢測(cè)GLUT-1的表達(dá) ?OCT包埋腦組織后，行冰凍切片切片以磷酸鹽緩沖溶液沖洗3 次，10 ml/dl 山羊血清封閉，PBS 沖洗，室溫孵育GLUT-1（Santacruze，sc-377228，美國(guó)）一抗2 h，后二抗孵育1 h，孵育完成后，切片滴加抗淬滅溶液后加蓋玻片保存，于共聚焦顯微鏡（Nikon，尼康A(chǔ)1型，日本）下觀察，采集圖片分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?采用SPSS 20.0 軟件分析，計(jì)數(shù)資料用（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠mNSS評(píng)分比較 ? 與假手術(shù)組的大鼠比較，模型組及米諾環(huán)素組大鼠在造模后的第1、3、7、14、28天時(shí)mNSS評(píng)分均較假手術(shù)組升高（P<0.05）;與模型組的大鼠比較，米諾環(huán)素組的大鼠的mNSS評(píng)分明顯降低（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠腦含水量的比較 ?與假手術(shù)組的大鼠比較，模型組及米諾環(huán)素組的大鼠在造模后第1、3、7、14、28天時(shí)大鼠腦含水量升高（P<0.05）。與模型組的大鼠比較，米諾環(huán)素組的大鼠的腦含水量降低，（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠腦VEGF及GLUT-1表達(dá)水平的比較 ?假手術(shù)組、模型組及米諾環(huán)素組GLUT-1的熒光強(qiáng)度分別為（68.76±5.47）、（35.85±3.39）及（46.82±4.25）;與假手術(shù)組的大鼠比較，模型組及米諾環(huán)素組的大鼠在造模后GLUT-1表達(dá)水平降低（P<0.05）。與模型組的大鼠比較，米諾環(huán)素組的大鼠的GLUT-1表達(dá)水平升高（P<0.05），見(jiàn)圖1、圖2;假手術(shù)組、模型組及米諾環(huán)素組VEGF的表達(dá)量分別為（78.32±6.21）、（39.52±4.63）及（58.37±5.03）。與假手術(shù)組的大鼠比較，模型組及米諾環(huán)素組的大鼠在造模后VEGF表達(dá)水平降低（P<0.05）;與模型組的大鼠比較，米諾環(huán)素組的大鼠的VEGF表達(dá)水平升高（P<0.05），見(jiàn)圖3、圖4。

3討論

腦出血是臨床常見(jiàn)的腦血管病之一，常見(jiàn)于中老年人，其發(fā)病率高、致殘率高且死亡率高，給社會(huì)及家庭帶來(lái)較沉重的負(fù)擔(dān)。目前腦出血缺乏有效的治療藥物，因此闡明腦出血的發(fā)病機(jī)制并探尋有效的藥物是目前臨床腦出血防治亟待解決的重大課題。