γ-干擾素釋放試驗在結核病診斷中的應用

董玉蘭 謝超 徐冉

摘要：目的 ?探討γ-干擾素釋放試驗（IGRAs）在結核病診斷中的應用價值。方法 ?選取2017年7月～2019年6月在景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院就診的100例疑似結核感染患者和50例健康體檢者作為研究對象，分別行γ-干擾素釋放試驗和涂片抗酸染色鏡檢。將最終確診為結核病患者48例設為結核病組，52例非結核病患者作為非結核病組，50例健康體檢者設為正常對照組。分析三組TB-IGRAs陽性率，對比肺結核病組涂陰與涂陽TB-IGRAs檢測結果，并比較TB-IGRAs與涂片抗酸染色對結核病的診斷效能。結果 ?結核病組IGRAs陽性率高于非結核病組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;涂陽肺結核和涂陰肺結核患者的IGRAs陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;IGRAs法敏感度為85.42%，特異性為89.22%，陽性預測值為78.85%，陰性預測值為92.86%;涂片抗酸染色法敏感度為22.92%，特異性為100.00%，陽性預測值為100.00%，陰性預測值為73.38%; IGRAs診斷結核病的敏感度高于涂片抗酸染色，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 ?IGRAs具有較高的敏感度和陰性預測值，對結核病的診斷具有較高的診斷價值，值得在臨床中應用。

關鍵詞：γ-干擾素釋放試驗;結核病;涂片抗酸染色

中圖分類號：R446.6;R378.91 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.021

文章編號：1006-1959（2019）21-0066-03

Abstract：Objective ?To investigate the value of Interferon-Gamma Release Assays （IGRAs） in the diagnosis of tuberculosis. Methods ?A total of 100 suspected tuberculosis patients and 50 healthy subjects from the First People's Hospital of Jingdezhen City from July 2017 to June 2019 were enrolled as Interferon-Gamma Release Assays and smear acid-fast staining. Microscopic examination. Forty-eight patients with tuberculosis were diagnosed as tuberculosis， 52 patients with non-tuberculosis as non-tuberculosis group， and 50 healthy subjects were set as normal control group. The positive rates of three groups of TB-IGRAs were analyzed. The results of TB-IGRAs test of smear and smear were compared with tuberculosis group， and the diagnostic efficacy of TB-IGRAs and smear acid-fast staining for tuberculosis was compared. Results ?The positive rate of IGRAs in the tuberculosis group was higher than that in the non-tuberculosis group and the normal control group，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the positive rate of IGRAs between smear-positive pulmonary tuberculosis and smear-negative tuberculosis （P>0.05）. The sensitivity of IGRAs method was 85.42%， and the specificity was 89.22%. The predicted value is 78.85%， the negative predictive value is 92.86%; the sensitivity of smear acid-fast staining is 22.92%， the specificity is 100.00%， the positive predictive value is 100.00%， and the negative predictive value is 73.38%; IGRAs is sensitive to the diagnosis of tuberculosis The degree was higher than the smear-resistant acid staining，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ?IGRAs have high sensitivity and negative predictive value， and have high diagnostic value for the diagnosis of tuberculosis. It is worthy of clinical application.

Key words：Interferon-Gamma Release Assays;Tuberculosis;Smear acid-fast staining

結核?。╰uberculosis）屬于一種由結核分枝桿菌（M. tuberculosis，MTB）引起的慢性傳染性疾病，由于人口密度的上升，致使該病在人群中的發(fā)病率極高，嚴重威脅了人類健康[1]。據(jù)2010年我國第五次結核病流行病學抽樣調(diào)查估計，結核病年發(fā)病例100萬，發(fā)病率78/10萬。通過加強結核病防治工作和落實結核病控制措施，近十余年來我國的結核病疫情呈下降趨勢，但我國原結核病疫情比較嚴重，各地區(qū)差異大，結核病防控工作任重而道遠[2]。如何快速發(fā)現(xiàn)患者的癥狀變化及準確診斷結核桿菌感染情況是提高結核病治愈率的關鍵。既往臨床上多采用微生物監(jiān)測（細菌痰培養(yǎng)、痰涂片）、影像學監(jiān)測（胸X線、肺CT）、分子生物學檢查（PCR技術）、結核菌素試驗（舊結核菌素或純化蛋白衍生物皮試）等常規(guī)操作診斷結核病，雖然對病情起到了一定的控制作用，但仍存在敏感性低、診斷效果不理想等諸多不足。因此，開發(fā)特異、敏感、快速、簡便的結核桿菌感染的診斷方法已經(jīng)成為全球共識。有研究發(fā)現(xiàn)，結核桿菌在特異性抗原的刺激下能釋放出γ-干擾素，故臨床上可用γ-干擾素水平來間接判斷是否感染結核病即γ-干擾素釋放試驗（IGRAs）。因此，本研究選取了100例疑似結核感染患者通過回顧性分析以評價IGRAs在臨床中的應用價值。

1對象與方法

1.1研究對象 ?選取2017年7月～2019年6月在景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院收治的100例疑似結核感染患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均知情同意并簽署知情同意書。根據(jù)患者的臨床癥狀，結合影像學、病理學檢查、結核治療有效性觀察及《臨床診療指南-結核病分冊》中的相關標準[3]，將最終確診48例結核病患者設為結核病組，其中男34例，女14例，年齡16～89歲，平均年齡（57.15±16.33）歲;非結核病患者52例設為非結核病組，其中男37例，女15例，年齡15～90歲，平均年齡（55.02±19.47）歲。另外選取該院體檢中心50例健康體檢者設為正常對照組。其中男35例，女15例，年齡18～85歲，平均年齡（53.20±16.19）歲。

1.2納入與排除標準 ?納入標準：①診斷明確，病歷資料完善者;②健康體檢者胸部X線及各項生理指標和身體機能基本正常。排除標準：①HIV陽性患者;②接受放、化療以及免疫抑制藥物治療患者和合并糖尿病患者。

1.3儀器與試劑 ?IGRAs檢測試劑購于武漢海吉力生物科技有限公司。免疫酶標分析儀為美國伯爵儀器有限公司（Bio Tek Instruments Inc） ELX800，洗板機為美國伯爵儀器有限公司ELX405。抗酸染色機為珠海貝索生物技術有限公司AUTO STAINER BSZ-GT116。顯微鏡為美國OLYMPUS CX21FS1。生物安全柜為濟南鑫貝西生物技術有限公司BSC-1100ⅡA2-X。

1.4方法

1.4.1全血γ-干擾素釋放試驗（TB-IGRAs） ?三組患者均于清晨空腹采用肝素抗凝采血管（美國BD制造）采集不少于4 ml的全血，打開生物安全柜的紫外燈照射15～20 min，3 h內(nèi)將全血送至檢驗科，將采集的抗凝全血顛倒混勻20次，每次吸取1 ml分別分裝至“N” （陰性對照）、“T” （檢測）、“P”（陽性對照）3個培養(yǎng)管中。于37℃水浴箱中培養(yǎng)20～24 h后，3000～5000 r/min下離心10 min，小心吸取上清液于1.5 ml標記好的離心管中用于IFN-γ含量檢測。IFN-γ含量的檢測使用酶標儀法。酶標板中每個目標孔加入50 μl稀釋液，然后再加入上述3個不同管上清液各50 μl，輕微振蕩混勻，同時各取 ? 100 μl按要求配置好的梯度校準品（6個濃度，每個濃度做2孔）按順序加入板孔中，封板，置37℃溫箱1 h;洗板，加入50 μl生物素抗體，封板，37℃溫箱中溫育30 min;洗板，每孔加入100 μl稀釋后酶復合物（按稀釋液：酶復合物=99∶1比例），37℃溫箱中避光溫育30 min;洗板，加入A、B顯色劑各50 μl，充分混勻，置黑暗條件下反應15 min后加入50 μl反應終止液，立即用美國伯爵免疫酶標分析儀讀取450 nm處的OD值（以630 nm為參考）。然后將N、P、T讀取的OD值代入標準曲線分別得到N、P、T三個濃度值（IU/ml）。結果判讀：T-N（IU/ml）≥0.35，且≥N/4判斷為陽性 。

1.4.2涂片抗酸染色鏡檢 ?三組患者均于清晨使用生理鹽水漱口，咳痰，取帶血或粘稠膿性的痰液;或非呼吸道樣本（如腦脊液、胸腔、盆腔積液、尿液等），連續(xù)3 d送檢。嚴格執(zhí)行相關操作規(guī)程，觀察油鏡下的狀態(tài)，若檢見抗酸桿菌，則結果為陽性，若未見抗酸桿菌，則結果為陰性。具體操作方法為：新鮮干凈玻片涂樣→自然干燥→固定→石碳酸復紅溶液加熱染色5 min→水洗→3%鹽酸乙醇脫色→水洗→亞甲藍溶液復染1 min→水洗后干燥鏡檢，保持復紅顏色為抗酸性細菌，藍色為非抗酸性細菌。結果判斷：油鏡下所見抗酸菌數(shù)量為0，則報告陰性-;1～9個/100個視野，則報告1+;1～9個/10個視野，則報告2+;1～9個/個視野，則報告3+;>9個/個視野，則報告4+。

1.5評價指標 ?分析三組TB-IGRAs檢測結果，對比涂陽肺結核和涂陰肺結核患者的TB-IGRAs陽性率，并分析TB-IGRAs與涂片抗酸染色對結核病的診斷效能。

1.6統(tǒng)計學方法 ?應用SPSS 12.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)并進行分析。計量資料使用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料使用（n，%）表示，比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組TB-IGRAs陽性率比較 ?結核病組TB-IGRAs陽性率高于非結核病組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2肺結核病組涂陰與涂陽TB-IGRAs檢測結果比較 ?涂陽肺結核和涂陰肺結核患者的TB-IGRAs陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 TB-IGRAs與涂片抗酸染色對結核病的診斷結果比較 ?TB-IGRAs診斷結核病的敏感度為85.42%（41/48），高于涂片抗酸染色的22.92%（11/48）（P<0.05）;TB-IGRAs診斷結核病的特異性為89.22%（91/102），陽性預測值為78.85%（41/52），陰性預測值為92.86%（91/98），涂片抗酸染色診斷結核病的特異性為100.00%（102/102），陽性預測值為100.00%（11/11），73.38%（102/139），見表3。

3討論

結核患者的細菌學檢查是臨床上常用的診斷方式，不僅可以作為制定治療方案的標準，也是評價治療有效程度的重要依據(jù)[4]。細菌學檢查可分為直接鏡檢法和分離培養(yǎng)法，直接鏡檢法具有快速、方便有效的特點。但細菌學檢查還存在一些缺點，如檢查過程中可能出現(xiàn)假陽性，涂片陽性并非一定為結核分枝桿菌。鏡檢水平及實驗室條件的參差不齊、標本中結核桿菌濃度必須大于5000條/ml、L-型結核桿菌對抗酸染色敏感度差導致結果有可能出現(xiàn)假陰性等，都會影響檢查的準確性[5，6]。此外，該方法對結核病變部位在肺外的及菌陰性肺結核的診斷難度加大，造成癥狀加重，增加死亡率。影像學檢查也是診斷結核病的常用手段，但當感染MTB患者癥狀不典型，病灶不明顯時，影像學檢查就無法做出準確診斷。結核病具有癥狀模糊、病情反復等特點，臨床上常造成漏診、誤診，不僅對患者身心造成傷害，也加重了家庭和社會的經(jīng)濟負擔。因此，如何準確、快速的診斷結核病是近年來廣泛醫(yī)護人員關心的熱點 話題。

1996年有學者在結核分枝桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)一段特殊的基因序列，該序列不存在于卡介苗菌株（BCG）和大部分非結核分枝桿菌（NTM）中[7]。當機體初次感染MTB時，T淋巴細胞會迅速過敏，當MTB再次入侵，特異性抗原ESAT-6和CFP-10會刺激活化的T細胞生成釋放γ-干擾素，因此，通過測定是否有γ-干擾素的存在可作為評價機體是否感染結核病的一種方法。IGRAs法靈敏度高，且不受卡介苗和大部分非致病分枝桿菌的影響在診斷結核病中脫穎而出。本研究結果顯示，結核病組TB-IGRAs陽性率（85.42%）高于非結核病組（15.38%）和正常對照組（6.00%），與國內(nèi)[8-11]和國外[12]的研究數(shù)據(jù)相符。而IGRAs對涂陽和涂陰肺結核患者的診斷陽性率分別為88.00%、81.82%，兩組間對比無明顯差異，也凸顯了IGRAs在菌陰性肺結核患者的應用優(yōu)勢。機體T細胞具有結核桿菌刺激記憶性，除完全治愈的患者外，IGRAs檢測在潛伏及發(fā)病結核病患者中均呈陽性[13]。

本研究通過設置陰性對照和陽性對照能夠更準確、客觀的評價受試者是否患病。相較于細菌學檢查的周期長、敏感性低的特點，IGRAs在卡介苗覆蓋率廣的地方及菌陰性結核、肺外結核的應用影響更為深遠[14]。本研究中，IGRAs法敏感度為85.42%，陰性預測值為92.86%，IGRAs診斷結核病的敏感性和陰性預測值均高于涂片抗酸染色，說明在我國高結核感染率的背景下，陰性結果對于排除結核病的診斷具有重要意義。但特異性和陽性預測值低于涂片抗酸染色，因此在兩者結果不相符的情況下，還需根據(jù)患者臨床癥狀和其他實驗室檢查綜合做出判斷。有研究指出，在MTB的刺激下效應T細胞會大量聚集在病變部位（即腦脊液、胸腔積液、肺囊腫液等）釋放γ-干擾素，即病變部位取樣的IGRAs診斷結果會更優(yōu)，但本研究取樣部位為全血，還待將來以病變部位樣本做進一步的研究。

綜上所述， IGRAs陰性結果對于排除結核桿菌感染的價值更大，陽性結果對于菌陰性肺結核具有重要的輔助診斷價值，值得在臨床中應用。

參考文獻：

[1]張春英.我國結核病防治服務體系的發(fā)展與展望[J].醫(yī)學信息，2015，16（43）：391-392.

[2]全國第五次結核病流行病學抽樣調(diào)查技術指導組.2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J].中國防癆雜志，2012，34（8）：485-508.

[3]中華醫(yī)學會.臨床診療指南-結核病分冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：1-46，122.

[4]Steingart KR，Dendukuri N，Henry M，et al.Performance of purified Antigens for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis：a metaanalysis[J].Clin Vaccine Immunol，2009，16（2）：260-276.

[5]葛均波，徐永健，王辰.內(nèi)科學[M].第9版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2018：62-74.

[6]鄧淵升.IFN-γ釋放檢測試驗的結核病診斷價值研究現(xiàn)狀[D].重慶醫(yī)科大學，2013.

[7]Lalvani A.Spotting latent infection：the path to better tuberculosis control[J].Thorax，2003，58（11）：916-918.

[8]王甲甲，唐義斌，張玲英.γ-干擾素釋放實驗在結核病診斷中的應用價值分析[J].分子診斷與治療雜志，2018，10（2）：115-119，137.

[9]劉紅，黃永杰，王靜，等.結核感染T細胞斑點試驗在疑似結核病患者診斷中的價值研究[J].中華結核和呼吸雜志，2014，37（3）：192-196.

[10]王華，甄拴平，高濤.結核感染T細胞γ干擾素釋放試驗（TB-IGRA）在結核病診斷中的應用[J].臨床醫(yī)學研究與實踐，2018，3（25）：97-98.

[11]伍仕敏，項杰，周虹，等.γ-干擾素釋放試驗在肺結核和肺外結核診斷中的應用[J].武漢大學學報（醫(yī)學版），2013，34（3）：403-406.

[12]Sester M，Sotgiu G，Lange C，et al.Interferon-gamma release assays for the diagnosis of active tuberculosis：a systematic review and meta-analysis[J].Eur Respir J，2011，37（1）：100-111.

[13]賈巖，馬俊鵬，張春梅，等.結核感染T細胞檢測在肺結核、肺外結核及潛伏性結核感染中輔助診斷的臨床運用[J].醫(yī)學信息，2015，28（32）：127.

[14]張培莉，劉義慶，邵婧，等.結核感染T淋巴細胞IFN-γ釋放實驗臨床檢測分析[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2017，32（1）：22-25.

收稿日期：2019-8-10;修回日期：2019-8-25

編輯/肖婷婷