P38、MAPK-1和AQP-4在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)大鼠創(chuàng)傷性腦水腫中的作用

方俊 姜永亮 黃波

摘要：目的 ?探討糖皮質(zhì)激素對P38、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK-1）的調(diào)節(jié)作用及其對大鼠創(chuàng)傷后腦組織水通道蛋白 4（AQP-4）表達(dá)的影響。方法 ?選擇SPF級雄性SD大鼠140只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量治療和高劑量治療組，各35只。假手術(shù)組單純實(shí)施開顱手術(shù)，模型組、低劑量治療組和高劑量治療組用Feeney's自由落體法制備大鼠腦創(chuàng)傷模型，高劑量治療組和低劑量治療組分別予高、低甲潑尼龍尾靜脈注射。分別于傷后0、6、24、72 h、7 d處死動物，取腦組織標(biāo)本，透射電鏡觀察各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，免疫組化法測定各組大鼠AQP-4、P38、MAPK-1的表達(dá)水平，用熒光探針原位雜交法測定AQP-4mRNA的表達(dá)。結(jié)果 ?①假手術(shù)組大鼠腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及細(xì)胞核完整清晰。模型組神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，胞漿疏松，細(xì)胞核固縮，凋亡小體形成。與模型組相比，低劑量治療組、高劑量治療組大鼠神經(jīng)細(xì)胞壞死程度均較輕。②低劑量治療組及高劑量治療組大鼠傷后24、72 h及7 d的AQP-4陽性表達(dá)率均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量與高劑量治療組間表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。低劑量治療組及高劑量治療組大鼠在傷后24、72 h及7 d的P38、MAPK-1陽性表達(dá)率均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量與高劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。③低劑量治療組和高劑量治療組的AQP-4mRNA陽性表達(dá)率在傷后24、72 h及7 d均低于模型組，高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;低劑量與高劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 ?糖皮質(zhì)激素可以降低大鼠創(chuàng)傷后腦組織AQP-4 的表達(dá)及腦損傷，其作用機(jī)制可能與抑制P38、MAKP-1激活、降低下游 AQP-4 的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：顱腦創(chuàng)傷;腦水腫;水通道蛋白 4;P38;MAPK-1;糖皮質(zhì)激素

中圖分類號：R743.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.019

文章編號：1006-1959（2019）21-0056-05

Abstract：Objective ?To investigate the effects of glucocorticoids on P38 and mitogen-activated protein kinase （MAPK-1） and their effects on the expression of aquaporin-4 （AQP-4） in rat brain after trauma. Methods ?A total of 140 SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group， model group， low-dose treatment and high-dose treatment group， 35 each. The sham operation group was only performed with craniotomy. The model group， the low-dose treatment group and the high-dose treatment group were prepared by Feeney's free fall method. The high-dose treatment group and the low-dose treatment group were given high and low methylprednisolone. Injection into the tail vein. The animals were sacrificed at 0， 6， 24， 72 h and 7 d after injury， and brain tissue samples were taken.The changes of nerve cell structure in each group were observed by transmission electron microscopy. The expression levels of AQP-4， P38 and MAPK-1 in each group were determined by immunohistochemistry. The expression of AQP4 mRNA was determined by fluorescence probe in situ hybridization. Results ?①In the sham operation group， the brain structure of the brain was basically normal， and the cytoplasm， cell membrane and nucleus were intact. In the model group， the volume of nerve cells was reduced， the cell membrane structure was destroyed， the cytoplasm was loose， the nucleus was pyknosis， and apoptotic bodies were formed. Compared with the model group， the degree of neuronal necrosis was lower in the low-dose treatment group and the high-dose treatment group. ②The positive expression rate of AQP-4 in the low-dose treatment group and the high-dose treatment group was lower than that in the model group at 24， 72 h and 7 d after injury，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the expression between the low-dose and high-dose groups （P>0.05）. The positive expression rates of P38 and MAPK-1 in the low-dose treatment group and the high-dose treatment group were lower than those in the model group at 24， 72 h and 7 d after injury，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference between the low-dose and high-dose groups （P>0.05）. ③The positive expression rate of AQP4 mRNA in low-dose treatment group and high-dose treatment group was lower than that in model group at 24， 72 h and 7 d after injury， which was significantly higher than that in sham operation group （P<0.05）.There was no significant difference between the low-dose and high-dose groups （P>0.05）. Conclusion ?Glucocorticoid can decrease the expression of AQP-4 and brain damage in rat brain after trauma， and its mechanism may be related to inhibition of P38， MAKP-1 activation and reduction of downstream AQP-4 expression.

Key words：Traumatic brain injury;Brain edema;Aquaporin 4;P38;MAPK-1;Glucocorticoid

創(chuàng)傷后腦水腫（cerebral edema）是顱腦損傷的重要病理生理過程，其發(fā)生由炎癥因子、神經(jīng)血管活性物質(zhì)、血腦屏障結(jié)構(gòu)改變等眾多因素參與。盡管近年來臨床進(jìn)行了大量的研究，但患者病死率、致殘率仍未顯著降低[1]。糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）是臨床廣泛用于治療各種炎性疾病和抗應(yīng)激的藥物，其抗炎作用主要通過與糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。GR主要存在于細(xì)胞漿中，與GC結(jié)合后，能快速進(jìn)入到細(xì)核內(nèi)，通過多種通路發(fā)揮抗炎作用。其主要作用機(jī)制包括直接的轉(zhuǎn)錄過程調(diào)節(jié)，干擾其它轉(zhuǎn)錄因子的作用等[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，GR可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路來實(shí)現(xiàn)其抗炎作用。MAPK家族主要包括 ERK（extracelluar signal-regulated kinase）、JNK（c-Jun N-terminal kinase）和P38MAPK，它們都參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展過程。其中P38MAPK是各類炎癥反應(yīng)的重要激酶，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)展與調(diào)節(jié)。研究證實(shí)，P38MAPK參與腦水腫的發(fā)生和發(fā)展，研究 GC與P38MAPK在創(chuàng)傷后腦水腫中的作用，有助于了解創(chuàng)傷后腦水腫的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，以及評估GC在腦水腫治療中的作用[3]。本研究主要探討糖皮質(zhì)激素對大鼠創(chuàng)傷后腦組織P38、MAPK-1的調(diào)節(jié)作用及其對腦組織水通道蛋白 4（AQP-4）表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 ?2016年2月～2018年3月選擇SPF級雄性SD大鼠140只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-00058，體重200～250 g。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、低劑量治療組、高劑量治療組，各35只。本研究已通過我院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批，實(shí)驗(yàn)過程符合實(shí)驗(yàn)動物倫理要求。

1.2試劑 ?二甲苯、蘇木精染液、1%伊紅酒精溶液、中性樹膠（國藥集團(tuán)），抗 P38MAPK抗體（sc-7972）、抗P-P38MAPK（sc-7973）、抗MKP-1抗體（sc-1199）、抗AQP4抗體（Santa Cruz 公司），二抗（鈺森生物）。

1.3模型制備 ?假手術(shù)組僅行開顱手術(shù)，模型組、低劑量治療組、高劑量治療組參考 Feeney's自由落體模型制作重度創(chuàng)傷性腦損傷模型，致傷力約為1000 g/cm2，致傷面積約6～8 mm2，下陷深度約 ? ? ? 2 mm，造成右側(cè)頂葉重度腦損傷;高劑量治療組 ? 使用甲潑尼龍20 mg/kg，于傷后即刻首劑尾靜脈注入，之后每24 h注射1次，連續(xù)3次。低劑量治療組使用甲潑尼龍2 mg/（kg·d），1日劑量分3次注射， ?1次/8 h，于傷后即刻首劑尾靜脈注入。

1.4動物模型評分標(biāo)準(zhǔn) ?大鼠蘇醒后立即按Zausinger法進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評分：0分：大鼠不能自發(fā)行走;1分：大鼠自發(fā)活動時(shí)向損傷對側(cè)進(jìn)行旋轉(zhuǎn);2分：提起大鼠尾巴，大鼠向損傷對策進(jìn)行旋轉(zhuǎn);3分：對抗病變部位阻力減低;4分：病變另一側(cè)的前爪不能伸直;5分：無任何神經(jīng)功能障礙;評分采用單盲法以減少誤差。選擇評分≤4分者，取出的腦組織檢查，確定有很明顯的腦損傷，視為造模成功。

1.5組織切片制備 ?達(dá)到預(yù)定時(shí)間（傷后0、6、24、72 h、7 d），各組分別取7只大鼠，麻醉大鼠，先后用4℃，0.9%氯化鈉注射液100 ml、4%多聚甲醛150 ml心臟灌洗，取腦，-80℃冰箱備用及固定、石蠟包埋。

1.6透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu) ?2.5%戊二醛，磷酸緩沖液配制固定2 h。用0.1 M磷酸漂洗液漂洗，1%鋨酸固定液固定3 h，0.1 M磷酸漂洗液漂洗3次。4℃，50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、 90%丙酮（1∶1）、90%丙酮、100%丙酮分次脫水。純丙酮+包埋液（2∶1）室溫 4 h，純丙酮+包埋液（1∶2）室溫過夜，純包埋液37℃3 h。37℃烘箱內(nèi)過夜，45℃烘箱內(nèi)12 h，60℃烘箱內(nèi)24 h固化。超薄切片機(jī)切片 50～60 nm。3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡觀察，拍片。

1.7免疫組化檢測AQP-4、P38、MAPK-1表達(dá)水平 ?取 4 μm 石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化處理后。立即投入3%H2O2甲醇（30%H2O2，1 ml，4 ℃避光+甲醇 ? ? 9 ml，現(xiàn)配現(xiàn)用）浸泡10 min。水洗3 min×2次，除去內(nèi)源性的過氧化氫酶?？乖迯?fù)：①高壓鍋修復(fù)：立即投入檸檬酸緩沖液，等到沸騰，浮子升起，計(jì)時(shí) ? ?2 min，自然冷卻至室溫。②血清修復(fù)：PBS 5 min/次，洗2次，擦干外圍，免疫組化筆勾圈，風(fēng)干15 s。滴加5%BSA封閉液，然后放入37℃溫箱30 min，甩去多余液體。加一抗，1∶100稀釋，濕盒中于4℃冰箱中保存過夜。加二抗，恢復(fù)到室溫后，PBS洗3次，5 min/次，濕盒中置于37℃溫箱中0.5 h。加DAB-H2O2顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。以細(xì)胞胞漿內(nèi)棕褐色顆粒為陽性，掃描結(jié)果用圖像分析軟件（IMAGE J）處理，分析陽性表達(dá)率。

1.8熒光探針原位雜交檢測AQP-4mRNA表達(dá) ?4%多聚甲醛固定組織，蔗糖脫水，OCT包埋切片。0.1 mol枸櫞酸緩沖液浸泡冰凍切片10 min，使組織細(xì)胞恢復(fù)水性?；蚬P畫圈，滴加蛋白酶K（20 μg/ml）消化8 min。純水沖洗后PBS洗3次，5 min/次。預(yù)雜交，滴加預(yù)雜交液37℃恒溫箱1 h。雜交，傾去預(yù)雜交液，滴加雜交液（含探針AQP-4 probe濃度 8 ng/μl），37℃雜交過夜。雜交后洗滌，洗去雜交液，2×SSC，37℃洗10 min，1×SSC，37℃洗2次，5 min/次，0.5×SSC 37℃洗10 min。鏡檢拍照，切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm，發(fā)藍(lán)光;FAM（488）綠光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm，發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm，發(fā)紅光。陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的熒光。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 ?所有數(shù)據(jù)均由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析釆用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織透射電鏡結(jié)果 ?假手術(shù)組大鼠腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及細(xì)胞核完整清晰。模型組神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，胞漿疏松，細(xì)胞核固縮，凋亡小體形成。與模型組相比，低劑量治療組、高劑量治療組大鼠神經(jīng)細(xì)胞壞死程度均較輕。各組大鼠腦組織電鏡照片見圖1。

2.2各組大鼠腦組織AQP-4、P38與MAPK-1蛋白表達(dá)情況 ?大鼠腦組織AQP-4表達(dá)在傷后6 h降低，24 h開始增高，傷后72 h達(dá)到最高值，傷后7 d恢復(fù)正常水平;低劑量治療組及高劑量治療組大鼠傷后24 h、72 h、7 d的AQP-4陽性表達(dá)率均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量與高劑量治療組間表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2。大鼠腦組織P38、MAPK-1表達(dá)在傷后6 h開始增高，傷后72 h達(dá)到最高值，傷后7 d恢復(fù)正常水平。低劑量治療組及高劑量治療組大鼠在傷后24 h、72 h、7 d的P38、MAPK-1陽性表達(dá)率均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;低劑量與高劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖3、圖4。

2.3大鼠腦組織AQP-4mRNA表達(dá)結(jié)果 ?從熒光強(qiáng)弱判斷大鼠腦組織AQP-4mRNA的表達(dá)，其在傷后24 h開始增高，傷后72 h達(dá)到最高值，傷后7 d恢復(fù)正常水平。低劑量治療組和高劑量治療組的AQP-4mRNA陽性表達(dá)率在傷后24 h、72 h、7 d均低于模型組，高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;低劑量與高劑量治療組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖5。

3討論

P38、MAPK 是人體內(nèi)廣泛分布的信號通路蛋白，可被炎癥反應(yīng)、應(yīng)激氧化與缺血缺氧等多種因素激活，在顱腦損傷后的病理生理信號傳導(dǎo)中起著重要作用。AQP-4是目前已發(fā)現(xiàn)的存在于動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要水通道蛋白，對腦組織的水平衡調(diào)節(jié)起著主要作用[4]。AQP-4的表達(dá)受蛋白磷酸化，蛋白間相互作用，缺氧等因素的影響[5，6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠損傷腦組織 P38、MAPK-1、AQP-4 及 AQP-4mRNA 的表達(dá)增高且伴神經(jīng)細(xì)胞破壞的增加，提示顱腦損傷后 P38-MAKP信號通路被激活，致使 AQP-4 高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腦水腫，加重神經(jīng)損傷。P38 的激活對創(chuàng)傷后腦水腫有著重要作用，抑制 P38 的激活可有效減輕腦水腫。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，治療組大鼠損傷區(qū)域腦組織 P38、MAPK-1、AQP-4 及 AQP-4 mRNA的表達(dá)降低且伴神經(jīng)細(xì)胞破壞減輕，提示糖皮質(zhì)激素可以抑制 P38、MAPK-1的激活，導(dǎo)致AQP-4 的表達(dá)下調(diào)，減輕腦水腫，降低腦損傷。但是抑制P38、MAPK-1，并不能完全下調(diào)AQP-4的表達(dá)，提示AQP-4可能是創(chuàng)傷后腦水腫發(fā)生的重要的或最終的靶效應(yīng)蛋白。損傷直接引起的細(xì)胞及膜結(jié)構(gòu)的改變，受破壞細(xì)胞內(nèi)成分異常流動，缺血缺氧再灌注損傷，有害神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等多種原因均可以通過多種途徑引起AQP-4蛋白表達(dá)的改變，進(jìn)而影響腦組織神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外水分子的流動分布[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素除了經(jīng)典的基因組效應(yīng)外還存在快速化非基因組效應(yīng)，這一效應(yīng)可以發(fā)生在中樞神經(jīng)。這一快速化非基因組效應(yīng)是GC直接透過血腦屏障與神經(jīng)細(xì)胞GR結(jié)合，通過對細(xì)胞內(nèi)信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)影響蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)GR在損傷腦組織中的表達(dá)水平降低，存在一定時(shí)相規(guī)律。在細(xì)胞水平，研究發(fā)現(xiàn)GC-GR結(jié)合后對MAPK系統(tǒng)的表現(xiàn)在：①直接或間接上調(diào)P38的表達(dá);②抑制ERK的表達(dá);③對JNK的作用具有細(xì)胞特異性。此外GC-GR還誘導(dǎo)上調(diào)MKP-1的活性和表達(dá)，對磷酸化的活性MAPK去磷酸化，進(jìn)而滅活MAPK（主要是P38和JNK）。在急性肺水腫、缺血性腦水腫及一些腫瘤中，均證實(shí)了糖皮質(zhì)激素的這種抑制作用，并通過這種抑制作用下調(diào)AQP的表達(dá)[8]。本研究證實(shí)了糖皮質(zhì)激素作用的時(shí)間變化規(guī)律，并且還發(fā)現(xiàn)低劑量組與高劑量組比較，AQP-4、P38、MAKP表達(dá)結(jié)果沒有明顯差異。提示糖皮質(zhì)激素對P38、MAPK-1的調(diào)節(jié)作用可能是通過與其位于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的受體（GR）結(jié)合后發(fā)揮的，因此沒有明顯的量效關(guān)系，也解釋了部分臨床上糖皮質(zhì)激素沖擊治療重型顱腦損傷效果不明顯的原因。

綜上所述，糖皮質(zhì)激素可以降低大鼠創(chuàng)傷后腦組織AQP-4 的表達(dá)及腦損傷，其作用機(jī)制可能與抑制 P38、MAKP-1 激活、降低下游 AQP-4 的表達(dá)有關(guān)。然而，糖皮質(zhì)激素對腦創(chuàng)傷后P38、MAPK-1及AQP-4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用不具有量效關(guān)系，其對腦損傷的治療作用有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2019-9-11;修回日期：2019-9-23

編輯/成森