長(zhǎng)雙歧桿菌BB68S體內(nèi)及體外安全性評(píng)價(jià)

張曉妹，葛紹陽(yáng)，桑躍，劉治麟

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心，廊坊 065201；3.北京和益源生物技術(shù)有限公司，北京 100089）

益生菌是一種活的微生物，當(dāng)攝入達(dá)一定量時(shí)能夠?qū)θ梭w健康起到促進(jìn)作用。其形態(tài)學(xué)、生化特性、生理功能和臨床應(yīng)用的研究已經(jīng)受到人們的廣泛認(rèn)可[1]。近年來(lái)，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)乳酸菌在人類健康及疾病中的作用有了更加全面及深入的認(rèn)識(shí)，多種益生菌的生理活性功能得到開(kāi)發(fā)利用，益生機(jī)制得到了深入的研究，包括改善腸道炎癥[2]、免疫調(diào)節(jié)、脂代謝調(diào)節(jié)[3,4]、預(yù)防過(guò)敏性疾病[5]等。

乳酸菌已經(jīng)有較長(zhǎng)的應(yīng)用歷史，長(zhǎng)期以來(lái)乳酸菌被人們應(yīng)用于酸奶發(fā)酵工藝中。另外，在天然發(fā)酵奶油的基礎(chǔ)上，結(jié)合乳酸菌的發(fā)酵方式可以得到人工發(fā)酵奶油。干酪作為食品已有9 000年歷史了，干酪的制作過(guò)程也是利用乳酸菌對(duì)乳酪蛋白進(jìn)行固化和壓縮處理。因此，在長(zhǎng)期的應(yīng)用過(guò)程中許多乳酸菌及其產(chǎn)品被公認(rèn)是相對(duì)安全的。但是與此同時(shí)一些潛在的安全問(wèn)題是不容忽視的，人們對(duì)乳酸菌安全性的認(rèn)識(shí)仍然不足。Gasser[6]在1994年的報(bào)道中稱乳酸菌引起的心肌膜炎占0.05%～0.4%，而鏈球菌-葡萄球菌引起的心肌膜炎比例高達(dá)79.3%。Donohue等[7]認(rèn)為乳酸菌中大多數(shù)乳桿菌是安全的，而鏈球菌和腸球菌屬的某些菌株為條件致病菌。

目前國(guó)際上對(duì)乳酸菌安全性的關(guān)注主要在以下幾方面：①感染能力。雖然大多數(shù)乳酸菌在長(zhǎng)期使用過(guò)程中被認(rèn)為是 “相對(duì)安全” 的，但已有相關(guān)報(bào)道指出乳桿菌、腸球菌等乳酸菌的攝入會(huì)引起菌血癥、心內(nèi)膜炎感染等疾病[8]。②產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物。在正常人的腸道中，腸道菌具有的氨基脫羧酶活性可將游離的氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺類物質(zhì)，而過(guò)量生物胺類能夠引起惡心、嘔吐、發(fā)燒等食物中毒的癥狀。③耐藥性及攜帶耐藥基因?？赡褪芸股氐娜樗峋鷷?huì)分泌具有降解抗生素作用的酶，也可能會(huì)把耐藥基因轉(zhuǎn)移給其他細(xì)菌。因此，有必要對(duì)益生菌進(jìn)行以上的安全性評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 菌株

長(zhǎng)雙歧桿菌BB68S，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC No. 14168，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)功能乳品實(shí)驗(yàn)室提供。金黃色葡萄球菌ATCC 25923，購(gòu)自中國(guó)普通微生物保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

脫羧酶培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g、酵母粉5g、牛肉膏5g、氯化鈉2.5g、葡萄糖0.5g、吐溫80 1g、MnSO40.5g、MgSO40.2g、FeSO40.04g、硫胺素0.01g、K2HPO42g、CaCO30.1g、溴甲酚0.06g、5’-磷酸吡哆醛0.05g、前體氨基酸5g，加去離子水至1L，調(diào)pH值至5.3～5.5，115℃滅菌20min。

MRS瓊脂培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗生素敏感性檢測(cè)

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法。BB68S和金黃色葡萄球菌ATCC 25923分別接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基，待表面干燥后把抗生素紙片放置在上面，37℃培養(yǎng)24h后，測(cè)定抑菌圈大小。

1.3.2 生物胺檢測(cè)

待測(cè)菌株在MRS培養(yǎng)基中活化2次；在含0.1%前體氨基酸（酪氨酸、組氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸）和0.005%磷酸吡哆醛-5-磷酸的MRS培養(yǎng)基中傳代5次（以此誘導(dǎo)脫羧酶）；將活化菌株接入脫羧酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)4d，觀察培養(yǎng)基顏色及測(cè)定培養(yǎng)基pH值，取樣進(jìn)行衍生，測(cè)定生物胺[9]。

1.3.3 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

SPF級(jí)Balb/C小鼠，6～8周齡，雌性。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房：溫度22±2℃，相對(duì)濕度55%±2%，12h燈照/黑暗循環(huán)，自由飲水和攝食。將小鼠隨機(jī)分為4組（每組10只）：灌胃組（3個(gè)組），分別以每天5×108cfu/鼠、5×109cfu/鼠和5×1010cfu/鼠BB68S劑量灌胃28d（每只小鼠每天0.2mL）；對(duì)照組，用生理鹽水灌胃。試驗(yàn)期間每天觀察小鼠的一般表觀、中毒表現(xiàn)和死亡情況，每周記錄小鼠的體重、攝食量。

1.3.4 血生化和血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)

取小鼠全血用全自動(dòng)血液分析儀（ H i t a c h i , Japan）檢測(cè)血常規(guī)項(xiàng)目，包括：紅細(xì)胞（RBC）、血小板、 血細(xì)胞壓積（ H C T ）、 平均紅細(xì)胞體積（MCV）、血紅蛋白、平均血紅蛋白濃度（MCHC）。全血離心取血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)生化項(xiàng)目，包括：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GRT）、總蛋白（TP）、白蛋白、血糖（GLU）、膽固醇。

1.3.5 細(xì)菌移位能力評(píng)價(jià)

分析小鼠血、肝臟、脾臟及腎臟的細(xì)菌移位情況。將50μL小鼠血涂布于MRS平板及BHI平板，于37℃下分別厭氧及有氧培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。取組織樣品，以1g/mL懸滴于無(wú)菌生理鹽水中，勻漿后取100μL分別涂布于MRS平板及BHI平板，按血樣同樣方法培養(yǎng)，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。有菌落生長(zhǎng)即記為陽(yáng)性。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理方法之間均值比較采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，不同處理之間移位率比較采用卡方檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗生素敏感性

已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌以及植物乳桿菌等乳酸菌天然對(duì)糖肽類抗生素如萬(wàn)古霉素具有普遍耐受性。表1結(jié)果表明，BB68S對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類、糖肽類部分抗生素及氨曲南的敏感性為R或者I，這與文獻(xiàn)報(bào)道的氨基糖苷類、喹諾酮類抗生素及胺曲南對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌效果普遍較差相符。從檢測(cè)范圍分析，菌株BB68S不存在種屬保守耐性以外的抗生素耐受性。菌株的這種固有耐性多為菌株縱向遺傳獲得，而非基因橫向轉(zhuǎn)移，耐性的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)小。

2.2 生物胺檢測(cè)

脫羧酶培養(yǎng)基中溴甲酚紫的有效指示范圍為pH 5.2～6.8，pH值在5.5時(shí)呈黃色，稍大于5.5就會(huì)出現(xiàn)顏色變化，呈現(xiàn)紫色或紫紅色。BB68S在改良脫羧酶液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4d，相對(duì)于空白對(duì)照培養(yǎng)基，添加了鳥(niǎo)氨酸、組氨酸、酪氨酸及精氨酸這四種不同氨基酸的液體培養(yǎng)基均呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明乳酸菌在其中可以正常生長(zhǎng)，而各培養(yǎng)基均呈黃色，表明菌株生長(zhǎng)并未導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值升高，初步判斷菌株未產(chǎn)生胺類物質(zhì)。

表1 試驗(yàn)菌株藥物敏感性能

2.3 口服BB68S急性毒性試驗(yàn)

血常規(guī)指標(biāo)異?？煞从吃囼?yàn)菌株在血液中的副作用，血生化指標(biāo)異常可反映營(yíng)養(yǎng)不足及代謝失衡的狀況，這些指標(biāo)的變化通常早于其他的臨床癥狀。表2結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組血常規(guī)和血生化指標(biāo)未發(fā)生任何顯著變化，說(shuō)明試驗(yàn)菌株對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物無(wú)不利影響。

表2 經(jīng)口灌胃組血常規(guī)指標(biāo)（n=10）

2.4 細(xì)菌移位檢測(cè)

細(xì)菌移位是益生菌安全性的最嚴(yán)重問(wèn)題之一。益生菌移位可能引發(fā)感染，包括菌血癥、敗血癥或心內(nèi)膜炎等[10,11]。因此，評(píng)價(jià)益生菌的移位能力是十分重要的。表3結(jié)果表明，對(duì)照組和試驗(yàn)組的組織和血液樣本經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，各培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明試驗(yàn)動(dòng)物的組織和血液沒(méi)有受到污染，菌株沒(méi)有從腸道轉(zhuǎn)移到組織和血液中，未發(fā)生移位現(xiàn)象。

表3 經(jīng)口灌胃組小鼠被試菌轉(zhuǎn)移到肝、脾、腎和血液的移位率

3 結(jié)論

長(zhǎng)雙歧桿菌BB68S不存在種屬特有耐性以外的抗生素耐受性，不存在抗生素轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)；產(chǎn)胺試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)生物胺的產(chǎn)生。口服不同劑量試驗(yàn)菌（108cfu/鼠、109cfu/鼠、1010cfu/鼠），小鼠均未發(fā)生不良反應(yīng)，試驗(yàn)菌未發(fā)生血液、肝臟、脾臟和腎臟的移位，表現(xiàn)出較高的移位安全性。長(zhǎng)雙歧桿菌BB68S安全性評(píng)價(jià)未發(fā)現(xiàn)菌株的不安全因素。