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    雷貝拉唑鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法的建立

    2019-12-04 04:15:51雷小平陳青連
    上海醫(yī)藥 2019年21期

    雷小平 陳青連

    摘 要 目的:建立控制雷貝拉唑鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素限度的方法。方法:按照《中國(guó)藥典》2015年版建立雷貝拉唑鈉細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢驗(yàn)方法。結(jié)果:使用靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn),得到雷貝拉唑鈉最高不干擾濃度為0.24 mg/ml。結(jié)論:對(duì)雷貝拉唑鈉可采用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn),其限度定為1 EU/mg,供試品檢測(cè)濃度為0.06 mg/ml,使用鱟試劑的靈敏度為0.06 EU/ml。

    關(guān)鍵詞 雷貝拉唑鈉 細(xì)菌內(nèi)毒素 凝膠法

    中圖分類(lèi)號(hào):R927.12; R975.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2019)21-0075-05

    Establishment of a method suitable for the bacterial endotoxin test in rabeprazole sodium

    LEI Xiaoping*, CHEN Qinglian**

    (Hangzhou Ausia Biological Tech Co., Ltd., Hangzhou 310018, China)

    ABSTRACT Objective: To establish a method for the control of the limit of bacterial endotoxin in rabeprazole sodium. Methods: The gel-clot method for the bacterial endotoxin test in rabeprazole sodium was established according to Chinese Pharmacopoeia (2015 ed.). Results: The test was carried out with tachypleus amebocyte lysate with sensitivity of 0.06 EU/ml. The maximum non-interference concentration of rabeprazole sodium was 0.24 mg/ml. Conclusion: Gel-clot method can be used to test bacterial endotoxin in rabeprazole sodium. The limit is 1 EU/mg. The detection concentration of the sample is 0.06 mg/ml and the sensitivity of tachypleus amebocyte lysate reagent is 0.06 EU/ml.

    KEy WORDS rabeprazole sodium; bacterial endotoxin; gel-clot method

    雷貝拉唑鈉是一種新型的質(zhì)子泵抑制劑,可于治療酸相關(guān)性疾病,如消化性潰瘍、胃食管反流性疾病、卓-艾氏綜合征等,具有選擇性強(qiáng)烈抑制幽門(mén)螺桿菌(Hp)作用,在臨床使用中有顯著性?xún)?yōu)勢(shì)[1-3]。注射用雷貝拉唑鈉在生產(chǎn)中控制熱原具有其必要性[4],通常采用加活性炭的方式[5-6]。但《已上市化學(xué)仿制藥(注射劑)一致性評(píng)價(jià)技術(shù)要求(征求意見(jiàn)稿)》中要求注射劑生產(chǎn)中不建議使用活性炭,為了有效去除熱原(細(xì)菌內(nèi)毒素),需加強(qiáng)對(duì)原輔包、生產(chǎn)設(shè)備等的控制[7-9]。采用的方法有家兔法測(cè)定熱原或凝膠法[10]和光度測(cè)定法測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素。由于家兔法更耗時(shí)、檢驗(yàn)成本更高,故通常采用制定細(xì)菌內(nèi)毒素限度的方式進(jìn)行控制。當(dāng)兩種檢測(cè)方法測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí),以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。故為了控制原料雷貝拉唑鈉中的細(xì)菌內(nèi)毒素,本研究特制訂其凝膠檢驗(yàn)方法。

    1 材料和方法

    1.1 儀器

    N10試管恒溫儀(杭州奧盛儀器有限公司);XH-D渦旋混合器(上海允延儀器有限公司);ML204T天平[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司];DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

    1.2 試藥

    雷貝拉唑鈉(珠海潤(rùn)都制藥股份有限公司,批號(hào):88817110102、88814080102);雷貝拉唑鈉(Metrochem API Private Limited,批號(hào):RBS/1508298);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(湛江安度斯生物有限公司,批號(hào):1708160、180101、1806131,效價(jià):10 EU/支) ;鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司,規(guī)格:0.1 ml/支,標(biāo)示靈敏度:0.25 EU/ml,批號(hào):1703013;標(biāo)示靈敏度:0.125 EU/ml,批號(hào):1804161;標(biāo)示靈敏度:0.06 EU/ml,批號(hào):1803051); 鱟試劑(福州新北生化工業(yè)有限公司,規(guī)格:0.1 ml/支,標(biāo)示靈敏度:0.25 EU/ml,批號(hào):17031712;標(biāo)示靈敏度:0.125 EU/ml,批號(hào):18041812;標(biāo)示靈敏度:0.06 EU/ml,批號(hào):17091312);稀釋劑Ⅱ(湛江安度斯生物有限公司,批號(hào):1801220;規(guī)格:4.0 ml /支);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(湛江安度斯生物有限公司,批號(hào):1608010、1804280;規(guī)格:5 ml /支)。

    1.3 方法

    取供試品,加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至濃度為2C的供試品儲(chǔ)備液與C的供試品溶液;用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋制成濃度為4λ的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液與濃度為2λ的陽(yáng)性對(duì)照溶液(B);取0.5 ml濃度為4λ的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液和0.5 ml濃度為2C的供試品儲(chǔ)備液混勻,作為供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液;以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照溶液。取鱟試劑,用0.1 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶后,分別加入0.1 ml供試品溶液、陽(yáng)性對(duì)照溶液、供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液、陰性對(duì)照溶液,各平行兩管,輕輕混勻后,放入(37±1)℃試管恒溫儀中,保溫(60±2)min。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

    根據(jù)其制劑注射用雷貝拉唑鈉原研說(shuō)明書(shū)中的用法用量:按靜脈輸注給藥,注射用雷貝拉唑鈉規(guī)格為20 mg,使用量為每日1瓶,滴注時(shí)間在15~30 min內(nèi)。計(jì)算確定雷貝拉唑鈉內(nèi)毒素的限值(L)為15 EU/mg[11]。

    本品為注射用雷貝拉唑鈉原料,為保證其制劑的質(zhì)量及用藥安全,該原料細(xì)菌內(nèi)毒素限值須嚴(yán)于其制劑臨床用藥計(jì)算的最大限制(15 EU/mg),考慮該制劑生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)用水及其它輔料的帶入,故我們將雷貝拉唑鈉內(nèi)毒素限值(L)1 EU/mg定為企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

    2.2 最低有效稀釋濃度的確定

    計(jì)算公式為C=λ/L。式中,C為最低有效稀釋濃度;λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度;L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值,以EU/mg表示,為1 EU/mg;當(dāng)λ為 0.25 EU/ml,C=0.25 mg/ml;λ為0.125 EU/ml,C=0.125 mg/ml;λ為0.06 EU/ml,C=0.06 mg/ml。

    2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

    將各靈敏度(λ)的鱟試劑用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1 ml復(fù)溶,分別加入2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 ml,每一個(gè)濃度平行做4管,另取2管加入0.1 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。當(dāng)最高濃度為2λ管均為陽(yáng)性,最低濃度0.25λ管均為陰性,陰性對(duì)照管均為陰性,試驗(yàn)方為有效。當(dāng)λc[λc= lg-1(∑X/4)]在0.5λ~2λ之間時(shí),結(jié)果均符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

    2.4 方法篩選

    2.4.1 選擇靈敏度0.25 EU/ml的鱟試劑

    取雷貝拉唑鈉,用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成濃度分別為2、1、0.5和0.25 mg/ml的溶液,并配制含2λ細(xì)菌內(nèi)毒素的各濃度供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液(PPC溶液)。取兩個(gè)廠(chǎng)家靈敏度為0.25 EU/ml復(fù)溶后的鱟試劑進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,其最高不干擾濃度為0.25 mg/ml。由于最高不干擾濃度與其最低有效稀釋濃度一致,故以該濃度檢測(cè)時(shí)存在風(fēng)險(xiǎn)。

    2.4.2 調(diào)節(jié)溶液pH

    由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí),溶液的pH 在6.0~8.0 的范圍內(nèi)為宜[8]。雷貝拉唑鈉用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成濃度0.25~2 mg/ml的溶液時(shí),pH為9.4~10.1,故使用稀釋劑Ⅱ稀釋至濃度為0.25~2 mg/ml,其相應(yīng)pH為6.8~7.0,滿(mǎn)足pH要求。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解雷貝拉唑鈉后,以稀釋劑Ⅱ作為稀釋劑,按2.4.1重復(fù)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)改變稀釋劑后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)改善,且稀釋劑Ⅱ?qū)棕惱蜮c溶解性較差,故仍使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為宜(表2)。

    2.4.3 改變鱟試劑靈敏度

    由于使用靈敏度0.25 EU/ml的鱟試劑檢驗(yàn)時(shí),其最低有效稀釋濃度為0.25 mg/ml,與其最高不干擾濃度一致,檢測(cè)存在風(fēng)險(xiǎn)。故通過(guò)減小所使用的鱟試劑靈敏度,減小其最低有效稀釋濃度。為保證所選用鱟試劑的可行性,通過(guò)檢驗(yàn)各靈敏度鱟試劑對(duì)應(yīng)的最低有效稀釋濃度的2倍(2C)濃度下對(duì)內(nèi)毒素是否凝結(jié),選定適宜靈敏度鱟試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用靈敏度0.25 EU/ml鱟試劑時(shí),濃度0.5 mg/ml對(duì)內(nèi)毒素凝結(jié)有干擾;使用靈敏度0.125 EU/ml時(shí),濃度0.25 mg/ml有干擾;使用靈敏度0.06 EU/ml時(shí),濃度0.125 mg/ml無(wú)干擾,故選擇靈敏度0.06 EU/ml鱟試劑進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

    2.5 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)

    取雷貝拉唑鈉,用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成濃度分別為0.48、0.24、0.12 和0.06 mg/ml的溶液,并配制各濃度供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液(PPC溶液)。取兩個(gè)廠(chǎng)家復(fù)溶后的鱟試劑(靈敏度0.06 EU/ml)進(jìn)行檢測(cè)干擾預(yù)實(shí)驗(yàn),其最高不干擾濃度為0.24 mg/ml(表3)。

    2.6 正式干擾試驗(yàn)

    用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制0.24 mg/ml的供試品溶液,濃度為2λ、λ、0.5λ和0.25λ的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液,及含0.24 mg/ml供試品的各濃度供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液(PPC溶液)。取兩個(gè)廠(chǎng)家復(fù)溶后的鱟試劑(靈敏度0.06 EU/ml)進(jìn)行檢測(cè),其中供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液平行4管,其余各平行2管。供試品溶液及陰性對(duì)照平行管為陰性,陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求,故實(shí)驗(yàn)有效;PPC溶液結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求,故供試品濃度為0.24 mg/ml時(shí),對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾(表4)。

    2.7 雷貝拉唑鈉樣品中內(nèi)毒素的檢測(cè)

    取供試品,加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成濃度為0.06 mg/ml的供試品溶液,用標(biāo)示靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑檢測(cè),結(jié)果符合規(guī)定(表5)。

    3 討論

    方法篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)使用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑檢測(cè)時(shí),其最高不干擾濃度為0.25 mg/ml,與其最低有效稀釋濃度一致,故采用最低有效稀釋濃度檢測(cè)時(shí),存在PPC管呈陰性的風(fēng)險(xiǎn)。由于其溶液pH不在6.0~8.0這一適宜pH范圍內(nèi),考慮使用稀釋劑Ⅱ作為稀釋劑,將pH調(diào)節(jié)至該范圍內(nèi),但干擾情況未得到改善,且發(fā)現(xiàn)使用該稀釋劑雷貝拉唑鈉溶解度變差,故仍以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為溶劑為宜。為減小供試品溶液檢測(cè)濃度,考慮使用小靈敏度的鱟試劑檢驗(yàn),為保證其2C濃度下無(wú)干擾,故選擇靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑。

    通過(guò)鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)得到兩個(gè)廠(chǎng)家鱟試劑均符合要求,采用兩個(gè)廠(chǎng)家鱟試劑進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最高不干擾濃度為0.24 mg/ml,并使用該濃度進(jìn)行正式干擾試驗(yàn),得到雷貝拉唑鈉濃度0.24 mg/ml時(shí),對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。

    采用凝膠法測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素操作簡(jiǎn)單,檢驗(yàn)周期短,對(duì)檢驗(yàn)的要求較低。雷貝拉唑鈉使用標(biāo)示靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑,采用凝膠法檢測(cè),供試品濃度不大于0.24 mg/ml時(shí),對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。故可采用凝膠法替代家兔法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)。

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