Notch1 小干擾RNA對人絨毛膜上皮癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響研究

曲平波 王春紅 夏維

摘 要 目的：通過siRNA技術(shù)，探討Notch1靶向沉默對人絨毛膜上皮癌JEG3細(xì)胞增殖及侵襲力的影響。方法：設(shè)計并合成Notch1-siRNA寡核苷酸鏈，將與人類基因無同源性的siRNA片段作為陰性對照，分別轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞。將JEG-3細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并分3組：未轉(zhuǎn)染正常對照組（NT）、轉(zhuǎn)染對照siRNA的陰性對照組（CS）、轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA基因沉默組（NS）。利用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果：NS組細(xì)胞增殖情況顯著低于NT組和CS組。侵襲實驗結(jié)果顯示NS組侵襲細(xì)胞數(shù)目（58.3±4.2）明顯少于NT組（109.2±6.3）與CS組（116.8±5.9）（P<0.05）。結(jié)論：Notch1靶向沉默能夠減緩JEG-3細(xì)胞增殖，降低侵襲能力，提示Notch1可能是治療人絨毛膜上皮癌的靶點。

關(guān)鍵詞 絨毛膜上皮癌 Notch1 siRNA JEG-3細(xì)胞

中圖分類號：R730.2313； R737.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）21-0066-05

Effects of Notch1 siRNA on the human chorionic carcinoma cell proliferation and invasive QU Pingbo1*， WANG Chunhong2， XIA Wei1

（1. Shanghai Shengdi Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Shanghai Shengzhao Biotechnology Company， Shanghai 201104， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the effects of Notch1 siRNA on the proliferation and the invasive ability of human chorionic carcinoma JEG-3 cell. Methods： Notch1 siRNA oligonucleotide chain was designed and synthesized and siRNA fragment with no homology to human gene was taken as a negative control， and they were respectively transfected into JEG-3 cells. The transfected JEG-3 cells were isolated， cultured and divided into three groups： the control group （NT） without any transfection， control group （CS） was transfected by control siRNA and Notch1 siRNA group （NS） was transfected by Notch1 siRNA. Cell proliferation was detected by MTT assay and the ability of cell invasion was assayed by Transwell invasion experiment. Results： The cell proliferation ability of NS group was significantly lower than the other two groups（P<0.05）. Transwell invasion experiment test results showed the number of cells （58.3±4.2） in the NS group was obviously less than NT group （109.2±6.3） and CS group （116.8±5.9） （P<0.05）. Conclusion： Notch1 targeted silence can slow the JEG -3 cell proliferation， reduce its ability to attack. Notch1 may be targeted for the treatment of human chorionic carcinoma.

KEy WORDS chorionic carcinoma； Notch1； siRNA； JEG-3 cells

絨毛膜上皮癌簡稱絨癌，是一種高度惡性的滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤?？稍斐蓢?yán)重的局部組織破壞，早期即可發(fā)生血道轉(zhuǎn)移而危及患者生命。隨著多藥聯(lián)合化療的進(jìn)展，絨癌患者的治愈率有了明顯的提高，但仍有相當(dāng)一部分病例治療效果不滿意。最新報道顯示，有14%的高危群患者因無法耐受化療藥的不良反應(yīng)而中斷療程，患者5年生存率僅有43%，這對絨癌治療藥物提出了新要求[1-2]。近年來分子靶向治療日益受到關(guān)注[3]，它以腫瘤細(xì)胞的特性改變?yōu)樽饔冒悬c，在發(fā)揮更強抗腫瘤活性的同時減少對正常細(xì)胞的毒性，使化療更加“有的放矢”。

Notch受體是由2 753個氨基酸殘基組成的單鏈跨膜受體蛋白，廣泛存在于多種物種中，在進(jìn)化上十分保守，屬于跨膜受體蛋白家族。Notch信號傳導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化及凋亡中發(fā)揮著多種功能，Notch信號的活化和抑制與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因此，調(diào)節(jié)Notch信號可能是腫瘤治療的一個新靶點。Notch1是Notch信號通路上的重要調(diào)節(jié)分子，Notch1信號與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，是腫瘤組織中最常表達(dá)的Notch家族成員之一[4-6]。在對人類T淋巴細(xì)胞白血病的研究中首次發(fā)現(xiàn)了Notch1信號通路與腫瘤的關(guān)系，大量實驗證明此通路的突變是急性T淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生的關(guān)鍵誘因[7-10]。Pang等[11]在對滋養(yǎng)細(xì)胞BeWo和JAR細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，Notch1可增強細(xì)胞的侵襲能力。Cobellis等[12]研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)減少下調(diào)了Notch蛋白的表達(dá)，從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的可控性侵襲，參與子癇前期的發(fā)病。由此可見，Notch信號傳導(dǎo)通路不僅與胎盤細(xì)胞分化、滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲密切相關(guān)，而且與胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)，該信號傳導(dǎo)通路發(fā)生異常，很有可能與絨毛膜癌的發(fā)生有關(guān)，但國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)未見報道。

本實驗擬通過建立JEG-3絨毛膜癌細(xì)胞模型，通過RNA干擾（RNA interference，iRNA）技術(shù)，轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞，使Notch1表達(dá)沉默，分別檢測對JEG-3細(xì)胞增殖以及侵襲能力的影響，旨在為進(jìn)一步尋找絨毛膜癌治療的一個新的靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

JEG-3細(xì)胞系購自中國科學(xué)院動物研究所計劃生育與生殖生物學(xué)國家重點實驗室；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；DMEM、胰酶購自美國Gibco公司；MTT、轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD購自美國Promega公司；HERAcell 150型CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司；半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司；PVDF膜購自美國邁博瑞公司；抗Notch1抗體購自英國Abcam公司；抗GAPDH抗體和RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

JEG-3常規(guī)復(fù)蘇后，置于含胎牛血清10%、谷丙酰胺2 mmol/L及丙酮酸鈉1 mmol/L的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3次傳代穩(wěn)定后，用于實驗。

1.2.2 合成Notch1-siRNA序列

查閱GenBank中Notch1序列（NM-001105721.1），設(shè)計siRNA片段，由上海吉瑪公司合成。Notch1-siRNA序列：5-CCGCCUUUGUGCUUCUGUU-3，Control siRNA序列：5-UUUUCGCAUCGAGUCACGUCU-3。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

實驗分組：將合成的Notch1-siRNA寡核苷酸鏈轉(zhuǎn)染到質(zhì)粒pGCsilencerTMU6/GFP上，同時將攜帶與人類基因無同源性的siRNA片段表達(dá)質(zhì)粒作為陰性對照，將兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行實驗。細(xì)胞共分為3組：常規(guī)培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染正常對照組（NT）、轉(zhuǎn)染Control siRNA的陰性對照組（CS）、轉(zhuǎn)染Notch1-siRNA基因沉默組（NS）。轉(zhuǎn)染時分別加入DMEM培養(yǎng)基/Fugene HD，Control siRNA/Fugene HD混合物和Notch1-siRNA/Fugene HD混合物。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，按照2×105個細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，加入無雙抗含10%胎牛血清DMED培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜至細(xì)胞密度為60%～80%。轉(zhuǎn)染前更換新鮮培養(yǎng)液無雙抗DMED培養(yǎng)基2 ml。用250 ml無血清DMEM分別對200 pmol/L siRNA和5 ml轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD進(jìn)行稀釋，于37 ℃孵育5 min，然后將二者混勻再次孵育20 min，將混合物逐滴加入6孔板，混勻，培養(yǎng)6 h后，換含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.2.4 Western-blot檢測各組細(xì)胞Notch1蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48～72 h后棄上清，用4 ℃預(yù)冷的0.01 mol/L PBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液，于冰上反應(yīng)20 min，離心，收集上清液獲得蛋白樣品。按照比例加入蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸（95 ℃，5 min），瞬間離心備用。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓為60 V，35 min，分離膠為120 V，60 min。半干轉(zhuǎn)儀PVDF膜200 mA，1 h。用5%的牛奶封閉液封閉90 min；然后分別加入一抗：抗Notch1抗體、抗GAPDH抗體（作為內(nèi)參校正），于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入二抗，于室溫孵育2 h，TBST洗膜3次；熒光顯色。利用Labwork分析軟件（基因公司）測定Western-blot條帶的吸光度值，并與GAPDH吸光度值的比值表示蛋白的相對含量。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況

細(xì)胞在6孔板轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞消化接種于96孔內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為1×104/孔，5% CO2孵箱培養(yǎng)，分別用MTT在12、24、36、48和60 h檢測細(xì)胞增殖情況：各孔加20 ml MTT溶液，室溫反應(yīng)1～4 h，棄上清，加入150 ml DMSO，震蕩10 min，于490 nm測定光吸收值，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞生長曲線圖。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力的檢測

包被基底膜：將Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶8比例混勻，取50 ml加入Transwell小室膜上室，風(fēng)干；水化基底膜，棄培養(yǎng)板中的殘留液體，并加入50 ml無血清培養(yǎng)液。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，用含有10 g/L BSA的無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞密度為1×105/ml。接種200 ml細(xì)胞懸液到上室中，將小室置于含600 ml 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的24孔板，孵育24 h，后用PBS淋洗，擦掉上室內(nèi)細(xì)胞，PBS洗3次，95%乙醇固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡隨機選取5個視野（200×），計數(shù)穿過小室膜孔的細(xì)胞。

1.2.7 Western-blot檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞，RIPA法提取蛋白，Western-blot方法檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)，方法同1.2.4。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗步驟至少重復(fù)3次，統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，如果P<0.05提示具有統(tǒng)計學(xué)意義，則進(jìn)一步采用最小顯著性差異法進(jìn)行組間兩兩配對比較。

2 結(jié)果

2.1 Notch1的表達(dá)水平

Western-blot檢測各組細(xì)胞Notch1蛋白的表達(dá)，通過灰度值檢測，顯示NS組Notch1蛋白表達(dá)水平明顯低于NT組及CS組，P<0.05（圖1）。

2.2 細(xì)胞增殖能力的檢測結(jié)果

MTT結(jié)果顯示，第36、48和60 h三個時間點，NS組細(xì)胞增殖明顯低于另外兩組細(xì)胞，而NT與CS兩組細(xì)胞增殖無明顯差別（P<0.05，圖2）；NT與CS組性別增殖速度無明顯差別（圖2）。

2.3 組細(xì)胞侵襲能力的檢測結(jié)果

分別對三組細(xì)胞穿過Transwell小室膜的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果顯示NS組細(xì)胞數(shù)目（58.3±4.2）明顯少于NT組（109.2±6.3）與CS組（116.8±5.9），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而NT與CS組細(xì)胞間穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平

Western-blot檢測各組細(xì)胞Notch1蛋白的表達(dá)，通過灰度值檢測，顯示NS組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯低于NT組及CS組（P<0.05）；而NT與CS組間細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)無明顯差異（圖3）。

3 討論

siRNA是通過雙鏈RNA分子在mRNA水平上將相應(yīng)序列的基因關(guān)閉或者沉默的過程。iRNA技術(shù)通過siRNA介導(dǎo)，具有高度的穩(wěn)定性、特異性，成功率高，且抑制范圍廣泛，近年來，被廣泛應(yīng)用于對細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及基因表達(dá)的研究領(lǐng)域。本實驗通過siRNA技術(shù)，沉默JEG-3細(xì)胞Notch1基因，檢測對JEG-3細(xì)胞的增殖以及侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，JEG-3細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，Notch1蛋白表達(dá)明顯下降，提示通過iRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染siRNA Notch1基因成功，且轉(zhuǎn)染率達(dá)到90%以上。轉(zhuǎn)染后，通過MTS法檢測JEG-3細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)JEG-3在轉(zhuǎn)染Notch1-siRNA后，細(xì)胞增殖速度明顯低于另外兩組細(xì)胞，說明沉默Notch1具有下調(diào)JEG-3細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)而提示沉默Notch1可能是控制絨癌發(fā)生發(fā)展的有效途徑。惡性腫瘤治療效果不佳的最主要原因在于其侵襲性生長，并造成轉(zhuǎn)移灶的形成，因此，明確Notch1沉默后JEG-3細(xì)胞侵襲能力的改變，對研究Notch1沉默對絨癌的治療前景有重要意義?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9在腫瘤組織中表達(dá)，在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Notch1，能夠活化NF-κB信號通路，使MMP-9表達(dá)增加，從而明顯促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，而應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默Notch1基因后，則得到抑制腫瘤侵襲的結(jié)果，說明通過調(diào)節(jié)Notch1表達(dá)調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，從而調(diào)節(jié)胰腺癌的侵襲過程[13]。此外有研究表明Notch1與MMP-2和MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)[14]。目前研究普遍認(rèn)為，基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟，基質(zhì)金屬蛋白酶是目前唯一能降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶類，可以結(jié)合并活化腫瘤細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，對細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本實驗通過Transwell侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn)，Notch1沉默后細(xì)胞穿過小室細(xì)胞數(shù)明顯減少，且對侵襲相關(guān)因子MMP-2、MMP-9的檢測發(fā)現(xiàn)，Notch1沉默后兩種因子的表達(dá)均明顯下調(diào)，說明Notch1沉默后，JEG-3細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)下調(diào)，侵襲能力明顯受到抑制。

Notch1靶向沉默能夠減緩JEG-3細(xì)胞增殖能力，同時可能通過下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)，降低其侵襲能力，提示Notch1是影響JEG-3細(xì)胞增殖、侵襲的重要因子， Notch信號通路可能成為治療人絨毛膜上皮癌新的靶點。

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