肥大細胞通過TGF-β/MMP2信號通路促進腎癌細胞侵襲遷移的研究

陳玉樂，呂 偉，楊文杰，劉天杰，李 磊

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

腎癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的疾病，約1/3的腎癌患者會因腫瘤轉(zhuǎn)移而死亡[1]。進一步闡明腎癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制對于提高腎癌治療效果具有積極意義?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopeptidases，MMPs)類，如基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)在腎癌等腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2]。研究表明，腫瘤細胞和間質(zhì)細胞之間的相互作用與腫瘤進展過程關系密切。既往研究中我們發(fā)現(xiàn)，肥大細胞這一特殊類型間質(zhì)細胞在腎癌組織中聚集并對腎癌血管形成過程產(chǎn)生影響[3]。國內(nèi)有學者初步發(fā)現(xiàn)肥大細胞可促進腎癌的侵襲遷移[4]。然而，肥大細胞是否可通過MMPs影響腎癌侵襲轉(zhuǎn)移尚不清楚。本研究通過體外實驗初步探討了肥大細胞對腎癌體外侵襲遷移與MMPs的影響以及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與抗體逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自寶生物(大連)有限責任公司。Fast200總RNA極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司。Dulbecco’s Modified Eagle Media-F12(DMEM-F12)培養(yǎng)基及Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司。 Millicell小室購自Millipore公司。重組人TGF-β蛋白購自R&D公司，溶解于無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，使用時以0 nmol/L(對照)、100 nmol/L、400 nmol/L等終濃度培養(yǎng)細胞。MMP2、MMP9及GAPDH抗體購自Abcam公司。Matrigel購自BD公司。SB431542購自Selleck公司，溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，使用時以100 nmol/L終濃度培養(yǎng)細胞。

1.2 細胞培養(yǎng)人腎癌OSRC-2細胞系由西安交通大學泌尿外科研究所凍存保種，于含100 mL/L FBS的DMEM-F12常規(guī)培養(yǎng)。人肥大細胞HMC-1細胞系購自ATCC公司，于含100 mL/L FBS的IMDM常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2(體積分數(shù))。

1.3 HMC-1細胞條件培養(yǎng)基收集取對數(shù)生長期的HMC-1細胞，PBS離心洗滌后以不含F(xiàn)BS的DMEM-F12懸浮。調(diào)整細胞濃度后以5×106個/皿的密度接種到10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為10 mL不含F(xiàn)BS的DMEM-F12。培養(yǎng)24 h后用孔徑為0.44 μm的濾器過濾細胞上清液。使用時與新鮮無FBS的DMEM-F12按1∶1混合后再加入100 mL/L的FBS，對照組則用新鮮DMEM-F12加入100 mL/L的FBS。

1.4 RT-PCR實驗采用RT-PCR Fast200總RNA極速抽提試劑盒提取細胞總RNA，定量后按400 ng上樣量進行逆轉(zhuǎn)錄反應。定量逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物后調(diào)整濃度為0.2 g/L，按1 μL上樣量(即200 ng)以SYBR Green I 嵌合熒光法進行real time RT-PCR反應。PCR反應引物序列如下：GAPDH上游5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3′,下游5′-GACGGTGCCATGGAATTTGC-3′；MMP2上游5′-ACAAAGAGTTGGCAGTGCAATA-3′，下游5′-CCGCATGGTCTCGATGGTAT-3′；MMP9上游5′-GTCATCCAGTTTGGTGTCGC-3′，下游5′-GGACCACAACTCGTCATCGT-3′。

1.5 Transwell遷移實驗胰酶消化OSRC-2細胞，加入含100 mL/L FBS的DMEM終止消化。PBS洗細胞3次以去除FBS。無FBS DMEM-F12重懸細胞后計數(shù)并調(diào)整細胞密度至1.25×105個/mL。向millicell小室的上室加入200 μL細胞懸液，即2.5×104個OSRC-2細胞。下室加入含100 mL/L FBS的DMEM-F12。隨后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出millicell小室，用棉簽擦去上室的細胞。PBS洗小室3次后將下室細胞置于多聚甲醛固定液中固定10 min。再用PBS洗小室3次，隨后將下室置于1 mL/L結晶紫溶液染色5 min。PBS洗去殘留結晶紫后置于顯微鏡下觀察。取10個隨機視野(×200)計數(shù)穿膜細胞個數(shù)并以其平均數(shù)代表體外遷移能力。

1.6 Transwell侵襲實驗無FBS DMEM-F12以1∶5的比例稀釋matrigel，以50 μL/孔鋪于millicell小室的上室，置于37 ℃培養(yǎng)箱4 h使其凝固。隨后向上室加入1×105個無FBS DMEM-F12懸浮的OSRC-2細胞，下室加入含100 mL/L FBS的DMEM-F12。其余操作同Transwell遷移實驗。

1.7 Western blot實驗胰酶消化OSRC-2細胞，計數(shù)后以2×106個/皿的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿。培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8 h使細胞貼壁。隨后棄培養(yǎng)上清，加入含或不含HMC-1細胞條件培養(yǎng)基的DMEM-F12培養(yǎng)48 h，用人膀胱癌UMUC-3細胞系總蛋白用作MMP9陽性對照。蛋白提取及Western blot實驗按照課題組所在實驗室常規(guī)步驟進行[5]。MMP2、MMP9及GAPDH一抗分別按1∶1 000、1∶1 000及1∶10 000進行稀釋。免疫印跡結果通過oddessy顯影系統(tǒng)進行顯影。

2 結 果

2.1 肥大細胞對腎癌細胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響提取肥大細胞HMC-1的條件培養(yǎng)基，并用其培養(yǎng)人腎癌OSRC-2細胞48 h后通過Transwell實驗檢測了OSRC-2細胞體外遷移及侵襲能力變化(圖1A)。體外遷移實驗顯示對照組及HMC-1條件培養(yǎng)基處理組穿膜細胞數(shù)分別為(78.33±9.02)個和(500.3±35.88)個，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；體外侵襲實驗顯示對照組及HMC-1條件培養(yǎng)基處理組穿膜細胞數(shù)分別為(51.33±13.37)個和(302.70±22.56)個，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 肥大細胞對腎癌細胞體外遷移、侵襲能力的影響

A：Transwell遷移和侵襲細胞實驗圖；B：體外遷移和侵襲實驗細胞計數(shù)及其柱狀圖*P<0.05。

2.2 肥大細胞對腎癌細胞體外MMP2、MMP9表達的影響通過real time RT-PCR實驗檢測經(jīng)HMC-1條件培養(yǎng)基處理后OSRC-2細胞MMP2、MMP9表達變化，發(fā)現(xiàn)肥大細胞可顯著促進OSRC-2細胞MMP2 mRNA表達，但對MMP9 mRNA表達無明顯影響(圖2A)。Western blot實驗進一步證實經(jīng)HMC-1條件培養(yǎng)基處理后OSRC-2細胞MMP2蛋白表達水平明顯上升。但在兩組細胞中均未檢測到MMP9蛋白表達(圖2B)。

圖2 肥大細胞對腎癌細胞MMP2、MMP9表達的影響

A：RT-PCR檢測結果，*P<0.05；B：Western blot檢測結果。

2.3 TGF-β信號在肥大細胞介導的腎癌侵襲遷移及MMP2表達中的作用不同濃度重組人TGF-β蛋白處理OSRC-2細胞48 h，提取總RNA后通過real time RT-PCR實驗檢測MMP2表達情況，結果表明TGF-β可呈濃度依賴性地促進OSRC-2細胞MMP2表達(圖3A)。隨后在普通培養(yǎng)及HMC-1條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的OSRC-2細胞加入TGF-β信號抑制劑SB431542，經(jīng)real time RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)SB431542可抑制HMC-1條件培養(yǎng)基引起的MMP2上調(diào)，但對普通培養(yǎng)的OSRC-2細胞MMP2表達無明顯抑制作用(圖3B)。這一結果表明肥大細胞可通過分泌TGF-β促進腎癌細胞MMP2表達。此外，通過Ttranswell實驗進一步發(fā)現(xiàn)，SB431542可抑制HMC-1條件培養(yǎng)基引起的OSRC-2細胞體外遷移及侵襲(圖3C、D)。

圖3 TGF-β信號在肥大細胞介導的腎癌侵襲遷移及MMP2表達中的作用

A：real time RT-PCR 檢測外源性TGF-β對OSRC-2細胞MMP2表達的影響，*P<0.05；B：real time RT-PCR 檢測SB431542對HMC-1條件培養(yǎng)基誘導的OSRC-2細胞MMP2表達的影響，*P<0.05；C：Transwell實驗檢測SB431542對HMC-1條件培養(yǎng)基誘導的OSRC-2細胞體外遷移、侵襲的影響；D：遷移和侵襲細胞計數(shù)，*P<0.05。

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個極其復雜的過程，大致需要經(jīng)歷脫離原發(fā)病灶、穿過基底膜進入血管、隨血液循環(huán)流動、逸出血管到達遠隔組織并形成轉(zhuǎn)移灶等多個步驟[6]。腫瘤細胞離開原發(fā)部位后，必須降解并穿過介于腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的由細胞外基質(zhì)組成的基底膜才能進入血管，實現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，包括腎癌細胞在內(nèi)的多種實體腫瘤細胞均可分泌多種蛋白酶，如MMPs、絲氨酸蛋白酶等。這些酶類可有效降解細胞外基質(zhì)，從而有助于腫瘤轉(zhuǎn)移。其中，MMP2和MMP9是研究較多的蛋白酶類成員，可顯著促進腎癌的侵襲轉(zhuǎn)移[7]。MMPs隸屬鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶，可降解細胞外基質(zhì)的多種成分，如膠原、纖維連接蛋白等[8]。MMPs對細胞外基質(zhì)的降解一方面可消除腫瘤侵襲屏障，使腫瘤更易侵犯鄰近組織；另一方面，細胞外基質(zhì)降解后細胞因子的釋放也可促進腫瘤生長及血管形成[8]。此外，MMPs也可通過切割細胞粘附關鍵分子等機制改變腫瘤細胞的運動能力。例如MMP2對層黏蛋白5的剪切可促進腫瘤的運動能力[9]。

TGF-β是腫瘤微環(huán)境中的重要成分之一，可由腫瘤細胞及間質(zhì)細胞等多種成分分泌[2]。TGF-β介導的下游信號激活是MMP2表達的重要調(diào)控因素之一[10]。同時，肥大細胞可通過分泌TGF-β參與多種病理生理過程[11]。TGF-β與其受體結合后可通過Smad依賴或非依賴方式介導信號轉(zhuǎn)導，調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[12]。早期研究表明，TGF-β在腎癌等腫瘤具有較高的表達水平，且血清與尿中的TGF-β水平與腎癌患者預后呈負相關[13]。近年來的多項研究表明，TGF-β在腎癌侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用，其機制包括誘導上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和干細胞表型[14]、Fascin1的表達等[15]。在膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中，TGF-β介導的MMP2和MMP9表達也是其促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制[10]。此前已有學者發(fā)現(xiàn)腎癌組織中的TGF-β表達與MMP2呈正相關[16]。在本研究中，我們通過添加外源性TGF-β處理腎癌OSRC-2細胞系，發(fā)現(xiàn)MMP2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，提示腎癌中TGF-β也可能通過促進MMP2表達參與侵襲轉(zhuǎn)移。

近幾年來，間質(zhì)成分在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用引起了科學界的廣泛關注。一方面，腫瘤細胞可通過分泌趨化因子招募并激活間質(zhì)細胞，導致間質(zhì)細胞在腫瘤微環(huán)境中聚集和成熟。另一方面，間質(zhì)細胞分泌的大量活性介質(zhì)又可促進腫瘤細胞的惡性生物學行為，包括增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成等[17]。作為腫瘤微環(huán)境中的重要一員，肥大細胞可分泌多種具有促進血管形成作用的活性分子，包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)和組胺等[18]。我們的前期研究證實，肥大細胞可在腎癌組織聚集并促進腎癌血管形成以及抗血管靶向治療抵抗[3]。在本研究中，我們通過肥大細胞HMC-1細胞系的條件培養(yǎng)基處理腎癌OSRC-2細胞，發(fā)現(xiàn)肥大細胞條件培養(yǎng)基可明顯提高腎癌細胞的體外侵襲遷移水平，表明肥大細胞不僅可促進腎癌血管形成，也可直接促進腎癌細胞的侵襲與遷移。

研究表明，肥大細胞可分泌豐富的TGF-β，是某些病理生理條件下TGF-β的重要來源之一[19]。同時，肥大細胞的功能也受到TGF-β的調(diào)節(jié)。因此，TGF-β是腫瘤細胞與肥大細胞“對話”的重要媒介[2]。在本研究中，我們通過體外實驗對肥大細胞引起的腎癌侵襲遷移機制進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)肥大細胞可通過分泌TGF-β促進腎癌MMP2表達，進而促進侵襲遷移。后續(xù)研究尚需通過動物實驗等驗證肥大細胞在腎癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，并進一步闡明肥大細胞分泌的TGF-β促進腎癌MMP2表達的詳細分子機制。