不同蛋白酶制備鵝肉呈味肽的對比分析

唐 霄，孫楊贏*，江雪婷，潘道東，鄭蘭亭，曹錦軒

（寧波大學 浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315800）

鵝肉是人們喜愛的禽肉之一，具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點，備受人們青睞，其營養(yǎng)豐富均衡、氨基酸組成合理，是制備呈味肽的理想優(yōu)質蛋白原料。呈味肽是增強食品原有風味的肽類物質，包括酸、苦、甜、鮮和咸味[1-2]，由于其安全性高、吸收性強的特點，在食品加工工業(yè)中逐漸得到應用。苗曉丹等[3]采用中性蛋白酶制備河豚呈味肽，所得酶解液鮮味突出，較好地保留了暗紋東方鲀肉湯濃厚、持久的感覺。陶正清等[4]對鹽水鴨水提物中的小分子肽進行了分離純化和結構鑒定，發(fā)現(xiàn)了3 條可能產生鮮味、甜味和濃厚感呈味肽，對鹽水鴨的滋味有一定的貢獻。李靜等[5]利用低值蝦制備呈味肽，研究了復合蛋白酶的酶解工藝，在最佳條件下，短肽（360～1 000 Da）得率達到42.93%，且風味良好。而目前鵝肉的研究主要集中在具有生理活性的抗氧化肽生產、水解工藝的優(yōu)化等[6-7]，利用鵝肉制備呈味肽的研究較少。

蛋白質酶水解有助于改善食品的營養(yǎng)價值和功能特性，陳怡穎等[8]對比分析了酶解液與雞湯中游離氨基酸的組成及含量，發(fā)現(xiàn)酶解液中的游離氨基酸總含量相對雞湯顯著增加。中性蛋白酶是一類在中性條件下作用于蛋白質肽鍵的蛋白酶，其作用條件溫和、水解度高、風味佳，已廣泛用于生產高級調味品和食品營養(yǎng)強化劑，各種動物來源性抽提物生產功能性骨、水產提取物、肽等及研究開發(fā)一些高附加值的功能食品[9]，堿性蛋白酶是一類最適作用pH值為堿性的蛋白酶，可水解肽鍵、酯鍵、酰胺鍵，在食品行業(yè)可水解動植物蛋白[10]。風味蛋白酶為由米曲霉發(fā)酵產生的具備活性的酶，它能用于食品風味的改良[11]。此外，木瓜蛋白酶對許多蛋白質都有水解作用，具備酶活性高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點，是一種廣泛應用的商業(yè)酶[12]。這4 種酶在食品風味及品質調節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。

本研究以鵝肉為原料，選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶，以水解度、寡肽質量分數、感官評定和游離氨基酸的變化為依據，通過電子舌進一步確定呈味作用，研究不同種類的蛋白酶對鵝肉酶解制備呈味肽的影響，以期選出在相應條件下最適宜制備呈味肽的蛋白酶，對鵝肉滋味研究系統(tǒng)進行完善，為開發(fā)富含呈味肽的營養(yǎng)功能型鵝肉調味料提供重要的理論基礎，為推動鵝肉精深加工產業(yè)的發(fā)展，實現(xiàn)鵝肉加工副產物的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 只冷凍鵝分2 批次購自寧波清水浦市場，將其放入裝有冰袋的箱子，0.5 h內運回實驗室進行解凍。

中性蛋白酶（5×104U/g）、堿性蛋白酶（2×105U/g）、風味蛋白酶（15×106U/g）、木瓜蛋白酶（1×105U/g）（均為食品級） 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸均為國產分析純；茚三酮、氨基酸分析用緩沖液（均為色譜純） 百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

WJWX-A500型高速多功能粉碎機 上海緣沃工貿有限公司；XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；KDN-16C數顯溫控消化爐 上海新嘉電子有限公司；Centrifuge 5804R離心機 艾本德中國有限公司；Smartongue電子舌 上海瑞玢國際貿易有限公司；Infinite 200 Pro全波長掃描多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；L-3000型全自動氨基酸分析儀 蘇州華美辰儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將冷凍鵝肉裝于保鮮袋后浸泡在4 ℃水中進行解凍，解凍完畢后用大量清水洗凈，剔除所有鵝骨、鵝肉表面脂肪，將鵝肉剪成0.5 cm×2 cm×2 cm的小塊，用高速多功能粉碎機進行多次重復攪碎得到鵝肉糜，置于保鮮密封袋中放入-20 ℃冰箱凍藏備用，貯藏期限20 d內。

1.3.2 鵝肉蛋白酶解液的制備

稱取經過預處理的鵝肉糜125 g置于500 mL的燒杯中，按固液比1∶3（g/mL）加水，冰浴勻漿（10 000 r/min，3×30 s），將勻漿好的鵝肉用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調pH值至各蛋白酶的最適pH值，然后在恒溫水浴鍋中45 ℃預熱15 min，加入蛋白酶，在45 ℃恒溫酶解6.5 h，酶解完畢后于100 ℃水浴加熱10 min進行滅酶，冷卻到室溫，4 500 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液備用。4 種蛋白酶酶解條件見表1。

表1 4 種蛋白酶酶解鵝肉條件Table 1 Conditions for hydrolysis of goose meat by four proteases

1.3.3 總氮含量的測定

采用凱氏定氮法[13]。

1.3.4 水解度的測定

采用甲醛電位滴定法測定上清液氨基態(tài)氮含量，采用甲醛電位滴定法測定上清液氨基態(tài)氮含量，凱氏定氮法測定總氮含量，按照下式計算水解度[14]：

式中：V1為滴定樣品時消耗標準NaOH溶液體積/mL；V2為滴定空白時消耗標準NaOH溶液體積/mL；C為滴定時標準NaOH溶液濃度/（mol/L）；m為樣品質量/g。

1.3.5 寡肽質量分數的測定

小分子肽含量采用三氯乙酸法[15]，量取10 mL酶解液，加入10 mL 20%三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置10 min。將樣品溶液4 000 r/min離心10 min，測上清液總氮含量，用以表示酶解液中小分子肽含量。

1.3.6 氨基酸成分分析

1.3.6.1 氨基酸標準曲線繪制

精確稱取氨基酸混合標樣76.83 mg，用超純水定容至100 mL，即得2.5 μmol/mL標準溶液。從中準確移取2 mL混合溶液，加入2 mL含有多種標準氨基酸組分（2.5 μmol/mL）的混合液，用超純水定容至50 mL，即為0.10 μmol/mL混合標準溶液，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.6.2 氨基酸分析程序與條件[16]

氨基酸自動分析儀參數條件：分離柱（4.6 mm×60 mm），樹脂為陽離子交換樹脂；分離柱溫度57 ℃；檢測波長570 nm（脯氨酸為440 nm）；進樣量20 μL；緩沖液流速0.35 mL/min；反應液茚三酮試劑，流速0.35 mL/min；單元溫度135 ℃；使用自帶軟件進行數據分析，樣品中氨基酸含量以mg/100 g表示。

1.3.7 感官評價

感官評價小組由經過篩選和專業(yè)培訓的年齡介于20～25 歲之間的10 名感官評價員所組成，4 名男性、6 名女性。評價員分別對按1∶7比例稀釋過后，溫度保持在35 ℃左右的4 種鵝肉酶解液進行評價，評分采取5 分制[17]，具體評分標準見表2。

表2 鵝肉酶解液的感官評分標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of goose meat hydrolysates

1.3.8 電子舌測定滋味輪廓

Smartongue電子舌系統(tǒng)，由6 根化學傳感器陣列組成，能對酸味、咸味、鮮味等具有專一響應性。在測定4 種蛋白酶解液的滋味輪廓前，需對4 種酶解液進行稀釋（用純凈水按1∶7比例），每個樣品測定7 次。用NaCl（代表咸味）和谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）（代表鮮味）分別配成質量濃度為0.1、0.2、0.3 mg/mL的標準梯度溶液（0.1 mg/mL MSG、0.2 mg/mL MSG、0.3 mg/mL MSG、0.1 mg/mL NaCl、0.2 mg/mL NaCl、0.3 mg/mL NaCl）。此外，分別用0.1、0.2、0.3 mg/mL NaCl和0.1、0.2、0.3 mg/mL MSG配成對應的混合液（0.1 mg/mL（MSG＋NaCl）、0.2 mg/mL（MSG＋NaCl）、0.3 mg/mL（MSG＋NaCl））作為參照的標準梯度溶液[18]，測量前對電子舌進行自檢、活化、校準和診斷等步驟，以確保采集所得數據的可靠性和穩(wěn)定性。

1.4 數據處理

數據采用SPSS 18.0進行相關數據的方差分析和顯著性檢驗，每組實驗數據重復測定3 次，采用Origin 8.0制圖。電子舌采集數據根據系統(tǒng)自帶軟件AlphaSoft進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類對鵝肉酶解液的水解度、寡肽及氨基酸含量的影響

表3 不同鵝肉酶解液對應的水解度和寡肽含量Table 3 Hydrolysis degrees and oligopeptides content of different goose meat hydrolysates

如表3所示，木瓜蛋白酶酶解產物的水解度最大，為31.41%。其次是中性蛋白酶及堿性蛋白酶，而風味蛋白酶的水解效果最差，僅為7.97%。在相同的酶解條件下，不同蛋白酶對鵝肉蛋白酶解效果不同，這主要是由酶的專一性所決定，酶的專一性決定它只能作用于某些特定的位點，所以即使是同樣的底物，不同酶的水解效果會有所不同[19]。此外，木瓜蛋白酶酶解液的水解度大可能與其內切酶特性和風味酶的外切酶特性有關，內切酶可以直接作用于蛋白質肽鏈的中間位點，而風味蛋白酶是外切酶，外切酶只有從蛋白質肽鏈的兩端酶解，缺乏足夠多的端點，風味酶酶解產物的水解度較低[20-21]。因此，在水解度中風味蛋白酶與其他酶差別大于寡肽和氨基酸部分。其他3 種酶制備鵝肉呈味肽的效果明顯優(yōu)于風味蛋白酶。

木瓜蛋白酶酶解液中寡肽質量分數最高，為0.22%，此蛋白酶的活性位點能與底物充分接觸，使底物充分酶解。其次中性蛋白酶酶解液中寡肽質量分數較高，為0.18%，中性蛋白酶的酶解效果強于堿性蛋白酶和風味蛋白酶。在酶解過程中，鵝肉蛋白逐漸被水解為小分子肽及游離氨基酸[22]。因此，酶解液中寡肽質量分數也能反映蛋白酶水解效果的高低，含量高的酶解效果佳。酶解過程中產生的肽類物質對酶解液風味的影響，主要是部分寡肽與其他呈味物質發(fā)生協(xié)同作用，使酶解液風味飽滿、口感協(xié)調。寡肽一般由2～6 個氨基酸組成，一般來說，寡肽質量分數高的酶解液，其呈味肽的含量也可能相應較高[23-24]。根據水解度和寡肽質量分數的差異，說明中性蛋白酶、木瓜蛋白酶制備鵝肉呈味肽的效果明顯優(yōu)于堿性蛋白酶和風味蛋白酶。

表4 4 種鵝肉酶解液中氨基酸組成Table 4 Free amino acid compositions of four goose meat hydrolysates mg/100 g

游離氨基酸具有呈味閾值低、呈味能力強的特點，同時富有酸、甜、苦、咸、鮮5 種基本味感，其含量和種類會直接影響體系的整體風味[25]。由表4可知，鵝肉酶解液中游離氨基酸種類及含量豐富。中性蛋白酶酶解液中游離氨基酸總量最高為1 287 mg/100 g，其次是堿性蛋白酶酶解液和木瓜蛋白酶，分別為1 018、930 mg/100 g，而風味蛋白酶酶解液中游離氨基酸總量最低為489 mg/100 g，其酶的水解能力最差?？偟膩碚f，制備所得酶解液中的游離氨基酸能賦予食物特定的味感，為Maillard反應制備熱反應型肉味香精提供底物[26-27]。

經不同蛋白酶酶解后，4 種酶解液中游離氨基酸含量最高的為亮氨酸，其中堿性蛋白酶酶解液中的苯丙氨酸和亮氨酸含量相同，為140 mg/100 g，它們均為苦味氨基酸。Lioe等[28]研究發(fā)現(xiàn)苦味氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸，其含量低于呈味閾值時可增強其他氨基酸的鮮味和甜味。酶解液中對鮮味和甜味有重要作用的氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和脯氨酸總量很高，其中谷氨酸和天冬氨酸是主要的鮮味氨基酸，具有形成肉鮮味和緩沖咸味等味道的特殊功效[29-30]，而甘氨酸除本身提供的清香甜味外，還能減少苦味，從食物中除去不愉快的口味[31]。鵝肉酶解液中鮮甜呈味氨基酸含量分別為中性蛋白酶（377 mg/100 g）＞堿性蛋白酶（2 9 8 m g/1 0 0 g）＞木瓜蛋白酶（256 mg/100 g）＞風味蛋白酶（197 mg/100 g），占氨基酸總量的比例分別為29.29%、29.27%、27.53%和40.29%。由此可見，酶解液中均含有鮮甜味氨基酸，而風味蛋白酶酶解液中鮮甜呈味氨基酸的質量分數最高。其他氨基酸如蛋氨酸，它作為含硫氨基酸雖然本身不會產生肉香，但對酶解液風味的形成有重要的作用，其含量也在中性蛋白酶中最大，是熟肉香味的重要貢獻因素[32]。結果表明中性蛋白酶在甜味和鮮味兩項含量上高達377 mg/100 g，顯著高于其他3 種酶解液，且一些對呈味有幫助的氨基酸如蛋氨酸含量豐富，更利于改善產品風味，賦予其更加圓潤甘甜的口感。

2.2 感官評定結果

表5 鵝肉酶解液感官評分Table 5 Results of sensory evaluation for goose meat hydrolysates

由表5可知，4 種酶解液的共同特點是香味、濃厚感和鮮味評分普遍比較高，其中中性蛋白酶香味和鮮味的得分均為4 種酶解液中最高。蛋白酶在酶解過程中產生的疏水性氨基端會造成酶解液具有苦味，而苦味是酶解過程中應盡量避免的。對于4 種酶解液，苦味評分順序為木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞風味蛋白酶，分別為3.30、2.10、2.00、1.50 分，這可能是因為木瓜蛋白酶是巰基蛋白酶，易于釋放苦味氨基酸如賴氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸，因此會加重酶解液的苦味[33]，但就鮮味和酸味而言，風味蛋白酶的鮮味不夠且酸味明顯。綜上所述，感官評價實驗結果說明中性蛋白酶酶解液滋味特性優(yōu)于其他3 種酶解液，能更好地保留鵝肉的鮮味、濃厚感。

2.3 電子舌測定結果

利用電子舌自帶分析軟件對獲得的4 種酶解液及梯度溶液的信號數據進行PCA，如圖1所示，PC1和PC2的累計方差貢獻率為93.90%，大于85%，這表明PC1和PC2中的信息量能夠反映測定樣品的大部分信息情況[34]。同時通過對傳感器信號值進行處理區(qū)分指數達99.77，說明電子舌能夠完全區(qū)分4 種蛋白酶酶解液在滋味方面存在顯著的差異。

圖1 不同蛋白酶酶解液電子舌PCA圖Fig. 1 Principal component analysis plot for the electronic tongue results of goose meat hydrolysates prepared with different enzymes

中性蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶3 種酶解液的數據點距離較近且相對集中，但距離參比溶液（0.1 mg/mL（MSG＋NaCl））最近的是中性蛋白酶酶解液，說明中性蛋白酶酶解液的鮮咸味道更突出，而堿性蛋白酶酶解液與其他3 種酶解液和參比溶液都相距較遠，說明它的滋味與其他溶液有顯著區(qū)別，這與感官評定的結果不完全一致，可能是酶解液本身味道復雜、電子舌滋味強度依據單一純物質等多種原因造成的[3]。

3 結 論

采用感官結合電子舌的方法，并通過水解度、寡肽和氨基酸含量的差異分析不同蛋白酶酶解液。結果表明在45 ℃恒溫水浴酶6.5 h、加酶量1 200 U/g、固液比1∶3（g/mL）的條件下，木瓜蛋白酶酶解液的水解度和寡肽質量分數最大，分別為31.41%、0.22%，其次為中性蛋白酶。但中性蛋白酶制備的鵝肉蛋白酶解液得分最高，香味、鮮味最佳，味道濃郁且甜味和鮮味呈味氨基酸的含量顯著高于其他3 種酶，而木瓜蛋白酶酸味較重且鮮味比較弱，香氣不協(xié)調。因此，最終確定酶解鵝肉蛋白獲得呈味肽的最佳酶為中性蛋白酶。中性蛋白酶在鵝肉酶解過程中小分子肽及游離氨基酸含量不斷變化，它們相互作用，使得酶解液整體鮮味濃厚，并伴有酸味，其呈味肽濃郁，持香時間久，整體風味良好。