熱脅迫和培養(yǎng)溫度對大腸桿菌抗熱性的影響

張愛靜，李琳瓊，朱 蕾，王鵬杰，高瑀瓏*

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

大腸桿菌（Escherichia coli）是一種在自然界和動物腸道內(nèi)廣泛存在，極易造成食品污染的革蘭氏陰性菌[1-3]。其在自然界中常常要面臨一系列的高溫、低溫、酸、堿、滲透壓等不適環(huán)境的脅迫，由于被不適條件脅迫，誘發(fā)大腸桿菌啟動自我保護機制，多數(shù)微生物通過對不斷變化的外界環(huán)境的適應(yīng)進行生長繁殖。事實上，在食品生產(chǎn)加工過程中食品原料中的許多微生物經(jīng)常處在脅迫環(huán)境中，面對不適宜其生長繁殖的環(huán)境條件，其生理代謝會作出應(yīng)激反應(yīng)，這種對不良環(huán)境的適應(yīng)能夠使其生存[4-7]。當(dāng)微生物經(jīng)歷一些不適的脅迫環(huán)境，之后再遇到同樣類型的不適環(huán)境時，其存活能力明顯提高，這種作用稱為同源性保護作用；而微生物經(jīng)一些不適環(huán)境脅迫，隨后在遇到不同類型的不適環(huán)境時，其存活能力明顯提高，這種作用稱之為交叉保護作用[8]。

高溫殺菌是目前食品工業(yè)中最常使用的一種滅菌加工手段[9]。微生物的耐熱性不僅受遺傳因素的影響，還受環(huán)境因素的影響[10]。微生物會對不利環(huán)境因素產(chǎn)生抗性或適應(yīng)性反應(yīng)，近年來引起了研究者的廣泛關(guān)注[11-13]。有研究報道，將乳酸桿菌脅迫于亞致死溫度50 ℃條件下30 min，隨后置于65 ℃，存活量較無脅迫原菌株增加10～100 倍[14]。Mackey等[15]研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌和李斯特菌在亞致死溫度48 ℃條件下脅迫處理一定時間后，其耐熱性比原菌株明顯提高。Juneja等[16]將產(chǎn)氣莢膜梭菌置于亞致死75 ℃熱脅迫后發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的菌株相比，100 ℃條件下殺死某細菌數(shù)量90%所需要的時間明顯增加，說明經(jīng)過亞致死熱脅迫后的菌體對熱致死環(huán)境產(chǎn)生了抗熱性。研究認為，微生物面對環(huán)境溫度的突然變化，其生理也會發(fā)生變化。如當(dāng)溫度突然上升，金黃色葡萄球菌會迅速作出熱激應(yīng)答，如誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達，合成熱休克蛋白[17-18]。對于大腸桿菌經(jīng)不同熱脅迫和培養(yǎng)溫度處理，是否可誘導(dǎo)其對熱抗性的變化，即是否產(chǎn)生同源保護作用目前尚不清楚，國內(nèi)外鮮見相關(guān)報道。因此，對大腸桿菌ATCC 43889經(jīng)不同熱脅迫和培養(yǎng)溫度誘導(dǎo)后的抗熱性進行研究，探明微生物的耐熱性是優(yōu)化食品熱加工殺菌條件的關(guān)鍵因素，以期為高溫殺菌技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，對于保障食品加工貯藏安全、建立食品質(zhì)量安全控制體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889，購自于江蘇省疾病預(yù)防控制中心，采用胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)[19]。供試菌經(jīng)活化后，接入TSB液體培養(yǎng)基，36 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h。

TSB、胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養(yǎng)基、NaCl 南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠；GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱、SF-CF-2A超凈工作臺 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；601超級恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；精密電子天平 北京塞多斯天平有限公司；上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；A1正置熒光顯微鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 熱脅迫處理大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889

將1.1節(jié)活化后的大腸桿菌ATCC 43889以體積分數(shù)1%轉(zhuǎn)接至150 mL新鮮的TSB培養(yǎng)基中，36 ℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h至穩(wěn)定期，分別取10 mL培養(yǎng)液加入無菌的中號試管（20 mm×200 mm），置于50、60 ℃和70 ℃進行熱脅迫處理，各處理15 min，取體積分數(shù)為1.5%～2%的各個溫度熱脅迫后的ATCC 43889菌種分別接種于新鮮的100 mL TSB培養(yǎng)基中，36 ℃振蕩培養(yǎng)18 h至穩(wěn)定期后，再分別取10 mL培養(yǎng)液加入無菌的中號試管，置于50、60 ℃和70 ℃進行熱脅迫處理，各處理15 min；以此類推，重復(fù)上述搖床振蕩培養(yǎng)和熱脅迫處理10 次，以備后續(xù)80 ℃熱處理。ATCC 43889的穩(wěn)定期是通過平板菌落計數(shù)方法結(jié)合比濁法測得的生長曲線獲得[20]。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889抗熱性參數(shù)D值的測定

微生物耐熱參數(shù)D值表示在一定的熱力致死溫度條件下殺死某細菌數(shù)量的90%所需要的時間。D值越大，表明細菌的耐熱性越強，該菌的死亡速率越慢；D值大小和抗熱性的強度呈正比[21]。

1.3.1 節(jié)對大腸桿菌ATCC 43889采用50、60 ℃和70 ℃三種熱脅迫溫度經(jīng)15 min各處理10 次，每種溫度每次熱處理時分別測定在3、6、9、12、15 min ATCC 43889存活量（3 個平行），共5 個時間點，以熱處理時間為橫坐標，存活量為縱坐標，對此5 個時間點進行線性回歸分析，所得線性回歸方程斜率的負倒數(shù)即為D值，分別測得ATCC 43889在50、60 ℃和70 ℃的D值，用線性回歸方程的決定系數(shù)R2評價此D值擬合度優(yōu)劣。不同溫度下D值的計算如式（1）所示：

式中：N0、Nt分別為熱處理前0時刻初始菌體的數(shù)量和熱處理t時刻之后菌體的數(shù)量。

1.3.3 不同溫度下培養(yǎng)大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889取1.1節(jié)活化的大腸桿菌ATCC 438895按體積分數(shù)1%接種至新鮮的TSB中，置于10、28、36 ℃和45 ℃，搖床振蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)120、24、18 h和20 h，達到穩(wěn)定期，以備后續(xù)80 ℃熱致死處理。不同培養(yǎng)溫度下ATCC 43889的穩(wěn)定期通過平板菌落計數(shù)方法結(jié)合比濁法測得的生長曲線獲得[20]。

1.3.4 大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889抗熱性模型的建立Weibull分布模型最初用于工程金屬零件的壽命和材料的疲勞測試，目前已被應(yīng)用于微生物的非線性致死動力學(xué)模型的擬合[22-23]。該模型能較好地模擬外界條件對細菌失活的影響，適用于熱力和非熱力細菌失活模型的擬合，Weibull模型按照式（2）表示：

式中：N0為0時刻初始菌體數(shù)量；Nt為熱處理t時刻后存活的菌體數(shù)量；t為熱處理時間/min；δ和ρ分別為Weibull模型的規(guī)模參數(shù)和形態(tài)參數(shù)，其中，δ表示菌體數(shù)量第1次減少10 倍所用的時間/min；ρ表示熱致死曲線的形狀，當(dāng)ρ=1時，曲線為直線；當(dāng)ρ＞1時，曲線向下彎曲，為凸形曲線；當(dāng)ρ＜1時，曲線向上彎曲，為凹形曲線[24-25]。

將1.1節(jié)活化的大腸桿菌ATCC 43889與1.3.1節(jié)經(jīng)50、60 ℃和70 ℃反復(fù)熱脅迫處理10 次傳代培養(yǎng)獲得的抗熱性的4 種ATCC 43889菌株，接種于新鮮的TSB中，36 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。按1.3.3節(jié)在10、28、36 ℃和45 ℃條件下140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)ATCC 43889菌株至穩(wěn)定期。分別將這8 種培養(yǎng)至穩(wěn)定期的大腸桿菌ATCC 43889的培養(yǎng)液10 mL加入無菌的中號試管，置于80 ℃進行熱處理，每隔2 min取樣，以滅菌生理鹽水適度稀釋，取適量菌懸液在TSA平板上涂布36 ℃培養(yǎng)72 h后，對培養(yǎng)液80 ℃處理前后進行平板菌落計數(shù)[20]。80 ℃ATCC 43889的存活量表達式為lg（Nt/N0），N0、Nt分別表示熱處理前初始菌體的數(shù)量和熱處理t時刻之后菌體的數(shù)量。以熱處理時間為橫坐標，ATCC 43889存活量為縱坐標，利用Weibull模型對80 ℃ ATCC 43889致死曲線進行非線性擬合，以此對比評價不同條件下的大腸桿菌ATCC 43889菌株對80 ℃抗熱性的強弱。

1.3.5 大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889熱脅迫前后菌落形態(tài)和個體形態(tài)的觀察

對未經(jīng)熱脅迫和1.3.1節(jié)經(jīng)過50、60 ℃和70 ℃熱脅迫處理10 次后獲得的ATCC 43889菌株在TSA平板上培養(yǎng)72 h后，用肉眼直接觀察ATCC 43889的菌落形態(tài)；用結(jié)晶紫與碘液單染色，通過光學(xué)顯微鏡分別觀察ATCC 43889個體形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究數(shù)據(jù)通過JMP（10.0）軟件處理，采用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較，結(jié)果以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱脅迫處理對大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889 D值的影響

表1 大腸桿菌ATCC 43889經(jīng)不同熱脅迫處理后D值的變化Table 1 Changes in D values of E. coli ATCC 43889 after heat stress treatment at different temperatures

從表1可知，所有處理組D值的擬合度均較高（R2＞0.93）；在50、60 ℃和70 ℃熱脅迫溫度作用下，隨著熱脅迫處理次數(shù)的增加，D值逐漸增大，表明ATCC 43889經(jīng)過反復(fù)熱脅迫后，對熱的抗性增加。在50 ℃脅迫條件下，ATCC 43889第1次熱處理后的D值為3.70 min，到第10次熱處理后，D值增加到6.96 min（P＜0.05），是第1次熱脅迫處理后的1.88 倍；在60 ℃脅迫條件下，ATCC 43889第1次熱處理后D值為3.92 min，到第10次熱脅迫后，D值增加到9.33 min（P＜0.05），是第1次熱脅迫時D值的2.38 倍；在70 ℃脅迫條件下，ATCC 43889第1次熱脅迫后D值為3.35 min，到第10次熱脅迫后，D值增加到27.40 min（P＜0.05），是第1次熱脅迫處理后的8.18 倍。熱脅迫溫度越高，D值越大，說明ATCC 43889抗熱性越強。ATCC 43889經(jīng)熱70 ℃反復(fù)脅迫作用后抗熱性增加的最快，顯著大于50 ℃和60 ℃脅迫后產(chǎn)生的抗熱性（P＜0.05），熱脅迫溫度為60 ℃時，ATCC 43889的抗熱性略高于50 ℃的抗熱性。

2.2 不同熱脅迫處理對大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889在80 ℃致死的影響

經(jīng)50、60 ℃和70 ℃熱脅迫處理10 次傳代培養(yǎng)獲得的大腸桿菌ATCC 43889的3 種耐熱性菌株與未經(jīng)熱脅迫的對照組，在80 ℃的熱致死曲線見圖1。利用Weibull模型對ATCC 43889三種耐熱性菌株與未經(jīng)脅迫對照組在80 ℃致死實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，以抗性參數(shù)δ評價ATCC 43889的抗熱性，通過JMP軟件內(nèi)部自動運行計算得出的抗熱性參數(shù)δ和ρ見表2。

圖1 不同熱脅迫處理大腸桿菌ATCC 43889在80 ℃的致死曲線Fig. 1 Death curve at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 undergoing different heat stresses

表2 不同熱脅迫大腸桿菌ATCC 43889在80 ℃的熱致死模型的擬合度及參數(shù)Table 2 Goodness of fit and parameters of thermal death models at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 subjected to different heat stresses

抗性大小與δ呈正比，δ值越大表示其抗熱性越強。由圖1可知，采用Weibull模型能較好地擬合ATCC 43889在50、60 ℃和70 ℃的熱脅迫后獲得的抗熱菌株在80 ℃作用下的失活曲線，擬合程度較高（R2＞0.953 8）。從表2也可看出，隨著脅迫溫度的升高，ATCC 43889抗熱性呈上升趨勢，無熱脅迫處理對照組、50、60 ℃和70 ℃，其抗熱性參數(shù)δ分別為0.64、0.80、1.13 min和1.92 min，其抗熱性存在顯著性差異（P＜0.05），表明隨著脅迫溫度的升高，其抗熱性顯著增加。熱脅迫溫度70 ℃時，抗熱性參數(shù)δ是原菌株的3 倍。經(jīng)過熱適應(yīng)的ATCC 43889比原菌株更加耐熱，80 ℃處理16 min后，未經(jīng)脅迫的對照組ATCC 43889數(shù)量下降了7.72 個對數(shù)，接近于全部死亡，而經(jīng)70 ℃熱脅迫的ATCC 43889，80 ℃處理16 min后，數(shù)量僅下降了3.36 個對數(shù)，ATCC 43889存活量明顯提高。ρ參數(shù)代表熱致死曲線的形狀，本研究ρ＜1，對于ATCC 43889，Weibull曲線向上彎曲，為凹形曲線，表明模型曲線隨著時間的延長下降趨勢減緩，ATCC 43889失活率降低。此研究結(jié)果表明，提高ATCC 43889的熱脅迫溫度可誘導(dǎo)其對抗熱性的增加。

2.3 不同溫度培養(yǎng)大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889在80 ℃的抗熱性

經(jīng)10、28、36 ℃和45 ℃培養(yǎng)后ATCC 43889在80 ℃其熱致死曲線見圖2。利用Weibull模型對不同的生長溫度下培養(yǎng)的ATCC 43889在80 ℃致死實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，用JMP軟件進行計算，獲得的抗性參數(shù)δ和ρ見表3。

圖2 不同溫度培養(yǎng)大腸桿菌ATCC 43889在80 ℃熱處理的致死曲線Fig. 2 Death curves at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 grown at different temperatures

表3 不同溫度培養(yǎng)大腸桿菌ATCC 43889在80 ℃熱處理抗熱性模型的擬合度和參數(shù)Table 3 Goodness of fit and parameters of heat resistance models at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 grown at different temperatures

由圖2可知，采用Weibull模型也能較好地擬合ATCC 43889經(jīng)4 種不同溫度培養(yǎng)后在80 ℃的失活曲線，擬合程度較高（R2＞0.993 6）。由表3可知，ATCC 43889培養(yǎng)溫度為10、28、36 ℃和45 ℃，其在80 ℃的抗熱性參數(shù)δ分別為2.16、2.24、3.29 min和5.69 min，隨著培養(yǎng)溫度的升高，其抗熱性顯著增大（P＜0.05）。與最適生長溫度36 ℃相比，生長溫度為45 ℃時，ATCC 43889抗熱性顯著增大（P＜0.05）；而生長溫度為10 ℃時，其對80 ℃較為敏感，抗熱性顯著降低（P＜0.05），生長溫度為45 ℃時抗熱性參數(shù)δ是10 ℃的2.63 倍。由表3可以看出，生長溫度為10 ℃和45 ℃時熱致死曲線的參數(shù)ρ＞1，曲線向下彎曲，為凸形曲線，表明抗性模型曲線隨著時間的延長下降趨勢變快，ATCC 43889隨著時間的延長死亡加快，失活率在增大；而生長溫度為28 ℃和36 ℃時熱致死曲線的參數(shù)ρ＜1，曲線向上彎曲，為凹形曲線，表明抗性模型曲線隨著時間的延長下降趨勢變慢，ATCC 43889隨著時間的延長，失活率在減小。上述研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度升高也可脅迫誘導(dǎo)ATCC 43889抗熱性的增加。

2.4 熱脅迫前后大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889菌落形態(tài)和個體形態(tài)

圖3 大腸桿菌ATCC 43889菌落形態(tài)Fig. 3 Colonial morphology of E. coli ATCC 43889

由圖3可以看出，未經(jīng)熱脅迫處理的對照組ATCC 43889培養(yǎng)72 h后，在TSA上菌落呈乳白色，邊緣整齊，表面有光澤，濕潤，光滑，正面和反面色澤一致；經(jīng)過50 ℃熱脅迫后的ATCC 43889，菌落形態(tài)與對照組無明顯差異；經(jīng)過60 ℃和70 ℃熱脅迫后，菌落發(fā)生明顯的變化，其表面呈褶皺狀、干燥，邊緣不整齊，呈鋸齒狀。

圖4 大腸桿菌ATCC 43889個體形態(tài)Fig. 4 Cellular morphology of E. coli ATCC 43889

由圖4可以看出，未經(jīng)熱脅迫處理的對照組ATCC 43889培養(yǎng)72 h后，在顯微鏡下個體呈短桿狀或球狀；經(jīng)過50 ℃熱脅迫后，個體形態(tài)略有變化，有極少數(shù)個體變長；而經(jīng)過60 ℃和70 ℃熱脅迫后，個體形態(tài)發(fā)生變化，幾乎均變?yōu)殚L桿狀，脅迫溫度越高，變化越明顯。

3 討 論

細菌的抗熱性受菌株種類、細胞狀態(tài)和環(huán)境因素的影響，熱脅迫一直是微生物學(xué)研究的熱點。每種細菌均有其最適生長溫度，當(dāng)溫度太高時會引起蛋白質(zhì)、酶失活，細胞膜破壞，核糖體、DNA、RNA等生物大分子降解[26]。

在食品生產(chǎn)加工過程中，微生物常常要遭受各種不適環(huán)境條件的脅迫，誘導(dǎo)出一系列自我保護機制，導(dǎo)致其對致死因素抗性增加。溫度是引起細菌細胞組成和生理變化的一個重要因素[27-29]。Heredia等[30]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌在55 ℃脅迫30 min，細胞的耐熱性增加了2～3 倍。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌ATCC 43889經(jīng)熱脅迫與升高培養(yǎng)溫度，其抗熱性均增加，經(jīng)50、60 ℃和70 ℃反復(fù)熱脅迫處理后，D值不斷增大，且脅迫溫度越高，D值越大，抗熱性越強；ATCC 43889在不同的培養(yǎng)溫度下，超過最適溫度能誘導(dǎo)其抗熱性升高，而低于最適溫度的培養(yǎng)，其抗熱性降低。ATCC 43889經(jīng)過50 ℃熱脅迫后，菌落形態(tài)與對照組無明顯差別；經(jīng)過60 ℃和70 ℃熱脅迫后，其菌落邊緣變得不整齊，表面粗糙且干燥，個體形態(tài)變長，呈長桿狀，熱脅迫溫度越高，這種變化越明顯，這種形態(tài)的變化可能有助于其避免高溫環(huán)境產(chǎn)生熱損傷。王麗平等[31]研究發(fā)現(xiàn)，某些抗生素作用大腸桿菌后能使其喪失原有的形態(tài)，變成細長的桿狀，這種形態(tài)的變化有助于其抵抗外界不利環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)，ATCC 43889經(jīng)熱脅迫后，可使其細胞形態(tài)也變成長桿狀。高溫使ATCC 43889形態(tài)變成長桿狀與其抗熱性的增強可能有一定的關(guān)系，對于高溫脅迫導(dǎo)致其抗熱性升高的作用機制正在研究。本研究發(fā)現(xiàn)熱脅迫對大腸桿菌ATCC 43889產(chǎn)生的同源性保護作用，熱脅迫是否能引起交叉保護作用的相關(guān)工作也正在研究。

4 結(jié) 論

大腸桿菌ATCC 43889經(jīng)50、60 ℃和70 ℃反復(fù)多次熱脅迫處理后，D值顯著增加，熱脅迫溫度越高，D值越大，說明其抗熱性越強。經(jīng)過熱脅迫后的ATCC 43889，菌落形態(tài)和個體形態(tài)發(fā)生了變化，熱脅迫溫度越高，形態(tài)變化越明顯。經(jīng)50、60 ℃和70 ℃熱脅迫處理10 次傳代培養(yǎng)的ATCC 43889在80 ℃的熱致死曲線表明，脅迫溫度越高，其耐熱性越強。在10～45 ℃培養(yǎng)，采用Weibull模型能較好地擬合ATCC 43889在80 ℃作用下的抗熱性曲線，隨著培養(yǎng)溫度的升高，ATCC 43889的抗熱性顯著增加。綜上，一定熱脅迫溫度和培養(yǎng)溫度的升高均有助于保護大腸桿菌ATCC 43889對熱處理的失活作用。