阿魏酸對(duì)糞腸球菌和屎腸球菌產(chǎn)酪胺機(jī)制的影響

薛林林，王 遠(yuǎn)，李彬彬，王慶玲，盧士玲,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000）

酪胺是一種生物胺，廣泛存在于奶酪、酒和發(fā)酵肉制品等食品中[1-3]。適量的酪胺對(duì)人體的某些生理機(jī)能具有調(diào)節(jié)作用，而攝入過(guò)量便會(huì)引起偏頭痛、高血壓以及腦出血等嚴(yán)重問(wèn)題[4-6]。腸球菌被認(rèn)為是酪胺的主要產(chǎn)生菌。Ladero等[7]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是存在于動(dòng)物、人體或是食品原料中的腸球菌都可以通過(guò)酪氨酸脫羧（tyrosine decarboxylase，TDC）途徑將酪氨酸轉(zhuǎn)化為酪胺。大量研究表明，在腸球菌TDC基因簇中編碼氨基酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase，tyrDC）和酪氨酸/酪胺透性酶（tyrosine/tyramine permease，tyrP）的基因通常是相鄰的，還具有酪氨酰-tRNA合成酶（tyrosyltRNA synthetase，tyrS）基因以及編碼Na＋/H＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na＋/H＋antiporter，nhaC）的基因[1,8]。

酚類(lèi)化合物是食用植物中最多樣化的次級(jí)代謝物之一，許多研究報(bào)道植物多酚提取物對(duì)不同的細(xì)菌活性具有抑制作用[9-11]。阿魏酸是酚類(lèi)化合物的一種，存在于糧食、蔬菜、水果和堅(jiān)果等原料中[12]。Chan等[10]證實(shí)阿魏酸可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌等致病菌的生長(zhǎng)。Lemos等[13]也表明阿魏酸和水楊酸可以破壞蠟狀芽孢桿菌和熒光假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)，起到抑制其生長(zhǎng)的作用。魏延玲等[14]發(fā)現(xiàn)阿魏酸能顯著抑制風(fēng)干鱸魚(yú)加工及貯藏過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)及生物胺的產(chǎn)生。而目前關(guān)于阿魏酸對(duì)腸球菌中酪胺產(chǎn)生影響以及產(chǎn)酪胺途徑中相關(guān)基因表達(dá)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)旨在利用阿魏酸對(duì)熏馬腸中高產(chǎn)酪胺的糞腸球菌和屎腸球菌產(chǎn)酪胺作用效果，并從分子生物學(xué)角度研究阿魏酸對(duì)腸球菌產(chǎn)酪胺TDC基因簇相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，明確了阿魏酸影響腸球菌產(chǎn)酪胺的機(jī)制，為將阿魏酸應(yīng)用于發(fā)酵食品中以提高其安全性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌XL-M76（Enterococcus faeciumXLM76），GenBank登錄號(hào)為MK201640；糞腸球菌XL-M66（E. faecalisXL-M66），GenBank登錄號(hào)為MK201639，由本實(shí)驗(yàn)室從熏馬腸中分離保存并送往華大基因測(cè)序鑒定。

阿魏酸（≥98%）、酪氨酸 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；M17肉湯 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；酪胺標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）、甲醇、乙腈（均為色譜純）美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑 美國(guó)Invitrogen公司；5×All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit) cDNA合成試劑盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix-No Dye 加拿大ABM公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND2000C型微量核酸測(cè)定儀 基因有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；5417R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司；LightCycler?480型熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司；ACQUITY Arc System高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Waters公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試菌菌懸液的制備

將本實(shí)驗(yàn)室從熏馬腸中分離的腸球菌菌株（-18 ℃甘油保藏）接種于M17肉湯培養(yǎng)基（pH 5.5）中，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化3 次，以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 阿魏酸對(duì)供試菌生長(zhǎng)的作用

準(zhǔn)備一批10 mL M17肉湯培養(yǎng)基，分為4 組，第1組為空白對(duì)照組，不添加酪氨酸和阿魏酸；第2組僅添加0.071%阿魏酸；第3組僅添加0.2%酪氨酸；第4組同時(shí)添加0.071%阿魏酸和0.2%酪氨酸。每組均含不添加供試菌株的陰性對(duì)照。接入200 μL供試菌株于37 ℃恒溫培養(yǎng)，在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、48 h取樣，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)菌懸液OD600nm值，并測(cè)量pH值，每組樣品各做3 個(gè)平行。

1.3.3 TDC基因簇相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

1.3.3.1 RNA的提取及cDNA的合成

取1.3.2節(jié)中生長(zhǎng)至穩(wěn)定期的各組菌懸液2.0 mL，于4 ℃、10 000 r/min離心3 min得菌體沉淀后，采用Trizol法提取細(xì)菌總RNA。提取完成后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，并使用微量核酸定量?jī)x測(cè)定各組總RNA濃度及其OD260nm/OD280nm值。待RNA完整性、濃度以及純度達(dá)到要求后使用去除gDNA污染的cDNA合成試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。20 μL體系加入2 μg總RNA。

1.3.3.2 RT-qPCR基因表達(dá)

表1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

向無(wú)酶八連管中加入10.0 μL的EvaGreen 2×qPCR MasterMix，2 μL的cDNA模板，上下引物各0.6 μL，加入無(wú)酶水補(bǔ)足至20 μL，輕微離心將反應(yīng)液混勻，用于反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）體系上機(jī)檢測(cè)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，40 個(gè)循環(huán)。每組樣品（包括陰性空白對(duì)照）做3 個(gè)平行。采用2-ΔΔCt計(jì)算方法[15]計(jì)算TDC基因簇基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 HPLC法測(cè)定菌懸液中酪胺質(zhì)量濃度變化

1.3.4.1 酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)量10 mg酪胺標(biāo)準(zhǔn)品，用0.4 mol/L的高氯酸溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，分別稀釋成終質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4.2 樣品的制備

取1.3.2節(jié)中供試菌菌懸液，于0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、48 h取樣，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集無(wú)細(xì)胞上清液。

1.3.4.3 衍生化

吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和無(wú)細(xì)胞上清液樣品各1 mL，置于5 mL棕色容量瓶中，按照Lu Shiling等[19]的方法進(jìn)行衍生化。衍生后樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾到樣品瓶中，用于上機(jī)檢測(cè)。每組樣品做3 個(gè)平行。

1.3.4.4 HPLC條件

色譜柱為Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為乙腈，色譜柱流速0.8 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫30 ℃，洗脫過(guò)程如表2所示。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2016建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Origin 2018b繪圖，并用SPSS 25做顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸對(duì)屎腸球菌和糞腸球菌生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，未添加阿魏酸的空白對(duì)照組細(xì)菌OD600nm值始終高于添加阿魏酸組，說(shuō)明阿魏酸有效抑制了糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76的生長(zhǎng)，使最終菌體數(shù)量減少，但阿魏酸并沒(méi)有改變2 株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)，只是延長(zhǎng)了其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這與先前報(bào)道的阿魏酸對(duì)其他菌的抑制效果類(lèi)似[20-21]。這是由于阿魏酸可以引起細(xì)菌細(xì)胞膜表面負(fù)電荷和疏水性改變，細(xì)胞膜局部破裂或形成孔洞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物外泄，從而達(dá)到良好的抑菌效果[13,22]。而添加酪氨酸對(duì)2 株腸球菌的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響（P＞0.05）。這與Bargossi等[23]研究得出酪氨酸可以加快糞腸球菌生長(zhǎng)速度的結(jié)果不同，這可能是因?yàn)槠湓诰昊罨A段分別接種于含或不含酪氨酸的培養(yǎng)基中，菌株已經(jīng)進(jìn)行酪氨酸的預(yù)適應(yīng)，而本實(shí)驗(yàn)中供試菌均在不含酪氨酸的培養(yǎng)基中活化，菌株利用酪氨酸生長(zhǎng)代謝較為緩慢。此外，由圖1可以看出，糞腸球菌XL-M66阿魏酸組最終OD600nm值較空白組降低了0.69，屎腸球菌XL-M76僅降低0.39；圖2中也發(fā)現(xiàn)糞腸球菌XL-M66阿魏酸組pH值下降趨于平緩，最終與空白組相差0.53，而屎腸球菌XL-M76 pH值下降較為迅速，僅相差0.30。綜合OD600nm值和pH值可以看出，糞腸球菌XL-M66對(duì)阿魏酸的敏感性更強(qiáng)。

圖1 阿魏酸對(duì)糞腸球菌XL-M66（A）和屎腸球菌XL-M76（B）生長(zhǎng)抑制作用Fig. 1 Effect of ferulic acid on the growth of E. faecalis XL-M66 (A)and E. faecium XL-M76 (B)

圖2 阿魏酸對(duì)糞腸球菌XL-M66（A）和屎腸球菌XL-M76（B）48 h生長(zhǎng)過(guò)程中pH 值的變化Fig. 2 Effect of ferulic acid on pH changes during growth of E. faecalis XL-M66 (A) and E. faecium XL-M76 (B)

如圖2所示，空白組培養(yǎng)液的pH值均在4 h后迅速下降，20 h后趨于平穩(wěn)，最終pH值穩(wěn)定在4.1左右。說(shuō)明2 株供試菌對(duì)數(shù)期均有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，進(jìn)入穩(wěn)定期之后，菌落數(shù)達(dá)到最大，培養(yǎng)基中能量被迅速消耗，代謝廢物增多，菌落活性減弱，pH值下降也隨之減慢。添加酪氨酸組的pH值始終高于空白組，且在菌株生長(zhǎng)初期，培養(yǎng)液pH值有微弱上升。這是由于酪氨酸是合成酪胺的必要物質(zhì)，隨著供試菌株的生長(zhǎng)繁殖，培養(yǎng)基中酪胺的質(zhì)量濃度在不斷積累，而酪胺屬于一類(lèi)堿性物質(zhì)，可以中和培養(yǎng)液中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，且在生長(zhǎng)初期，酪胺的產(chǎn)生速度略高于酸性物質(zhì)的產(chǎn)生速度。Fernández等[24]也證實(shí)在酪氨酸存在的情況下，產(chǎn)酪胺的堅(jiān)忍腸球菌能夠引起培養(yǎng)基pH值增加，而不產(chǎn)酪胺的突變體pH值則沒(méi)有變化。添加阿魏酸組的曲線較為平穩(wěn)且趨于穩(wěn)定后pH值要高于空白組，表明阿魏酸對(duì)2 株供試菌的生長(zhǎng)具有一定程度的抑制作用。

2.2 阿魏酸對(duì)供試菌株基因表達(dá)分析

腸球菌TDC基因簇中tyrDC、tyrP、tyrS和nhaC四種基因共同調(diào)節(jié)酪胺的生物合成，其中tyrDC負(fù)責(zé)酪胺的合成，tyrP則負(fù)責(zé)胞內(nèi)胞外酪氨酸-酪胺的交換[25-26]。通過(guò)RT-qPCR可以具體檢測(cè)TDC基因簇中4 種基因的表達(dá)情況。2 株腸球菌在不同條件下4 種基因的相對(duì)表達(dá)量如圖3所示。

由圖3可知，2 株菌添加酪氨酸組tyrDC、tyrP和nhaC的3 個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上均顯著上調(diào)（P＜0.05），其中糞腸球菌XL-M66酪氨酸組3 種基因表達(dá)水平分別達(dá)到空白組的30.1、40.0 倍和9.7 倍，屎腸球菌XL-M76為22.8、15.3 倍和47.8 倍。這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，酪氨酸為細(xì)胞堿化脫羧反應(yīng)提供了前體物質(zhì)，誘導(dǎo)tyrDC和tyrP基因的表達(dá)進(jìn)而合成酪胺抵抗胞外酸性環(huán)境[23,27]。雖然nhaC基因參與酪胺合成的具體功能作用還未可知，但可以確定的是酪氨酸可以促進(jìn)nhaC基因的表達(dá)。而tyrS基因的表達(dá)量隨酪氨酸的添加顯著減少（P＜0.05），其中糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76空白組基因表達(dá)量分別是酪氨酸組的11.9 倍和17.9 倍。Coton[28]和Linares[29]等研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌中tyrDC基因表達(dá)量與酪氨酸濃度呈正相關(guān)，而在缺乏酪氨酸情況下，tyrS基因被最大化轉(zhuǎn)錄，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。說(shuō)明tyrS基因可能是作為T(mén)DC基因簇遺傳調(diào)控的負(fù)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，用來(lái)防止酪氨酸的大量脫羧，確保有可用的酪氨酸用于細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成。與空白組相比，添加阿魏酸促進(jìn)了tyrS基因的表達(dá)，這可能是因?yàn)榘⑽核峤档土四c球菌菌株活性，使之利用培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成酪氨酸能力降低，培養(yǎng)液中游離的酪氨酸質(zhì)量濃度減少，所以tyrS基因轉(zhuǎn)錄增多，促使酪氨酸合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。而與酪氨酸組相比，添加阿魏酸對(duì)2 株供試菌的tyrS基因表達(dá)均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖3 阿魏酸對(duì)糞腸球菌XL-M66（A）和屎腸球菌XL-M76（B）TDC相關(guān)基因表達(dá)量影響Fig. 3 Effect of ferulic acid on the expression of tyramine synthesisrelated genes in E. faecalis XL-M66 (A) and E. faecium XL-M76 (B)

在酪氨酸存在情況下，添加阿魏酸可顯著降低2 株腸球菌tyrDC、tyrP基因的表達(dá)（P＜0.05），糞腸球菌XL-M66酪氨酸組tyrDC和tyrP基因表達(dá)量為酪氨酸＋阿魏酸組的7.6 倍和10.3 倍，而屎腸球菌XL-M76僅為5.4 倍和5.8 倍。表明阿魏酸對(duì)糞腸球菌XL-M66 tyrDC和tyrP基因轉(zhuǎn)錄影響要大于屎腸球菌XL-M76。而阿魏酸影響tyrDC和tyrP基因的轉(zhuǎn)錄，可能是影響了酪氨酸脫羧酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，使之對(duì)酪氨酸的感應(yīng)能力降低，從而使相關(guān)基因表達(dá)量降低。Kang等[30]研究表明煙酸可以顯著抑制屎腸球菌酪氨酸脫羧酶的活性和tyrDC基因的表達(dá)。此外，阿魏酸組與空白組的tyrDC和tyrP基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異，這表明只有在TDC途徑被誘導(dǎo)激活情況下，阿魏酸才會(huì)對(duì)tyrDC和tyrP基因起到抑制作用，進(jìn)一步說(shuō)明，阿魏酸是通過(guò)影響酪氨酸脫羧酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性控制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而減少酪胺的產(chǎn)生。由圖3B發(fā)現(xiàn)，阿魏酸顯著降低nhaC基因的表達(dá)（P＜0.05），其中酪氨酸組的nhaC基因表達(dá)量達(dá)到酪氨酸＋阿魏酸組的5.0 倍，而圖3A中，阿魏酸對(duì)糞腸球菌XL-M66 nhaC基因表達(dá)沒(méi)有顯著作用（P＞0.05）。

一些研究發(fā)現(xiàn)pH值是影響TDC基因簇表達(dá)的重要因素，相對(duì)較低的pH值更有利于TDC基因的誘導(dǎo)表達(dá)，且酪氨酸脫羧酶活性更高[18]。在酸性pH值和高濃度酪氨酸存在情況下，tyrDC和tyrP共同編碼的tyrDC-tyrP多順?lè)醋有攀贡徽T導(dǎo)激活，從而激活tyrDC和tyrP基因的表達(dá)[27]。圖3A中糞腸球菌XL-M66酪氨酸組tyrDC和tyrP基因表達(dá)量是酪氨酸＋阿魏酸組的7.6 倍和10.3 倍，而圖2A中酪胺酸組pH值始終高于酪氨酸＋阿魏酸組，最終pH差值在0.3左右。圖3B中，屎腸球菌XL-M76酪氨酸組tyrDC和tyrP基因表達(dá)量均達(dá)到了酪氨酸＋阿魏酸組5 倍以上，相同的是圖2B中酪氨酸組的pH值也處于較高水平，兩組pH差值為0.2左右。這說(shuō)明添加阿魏酸不僅直接抑制tyrDC和tyrP基因表達(dá)，也通過(guò)調(diào)控pH值的升高間接影響tyrDC和tyrP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。黃笠原等[31]在大蒜精油對(duì)德氏乳桿菌產(chǎn)腐胺機(jī)制影響研究中也表述了相同的結(jié)果。

2.3 阿魏酸對(duì)供試菌株產(chǎn)酪胺能力分析

圖4 阿魏酸對(duì)糞腸球菌XL-M66（A）和屎腸球菌XL-M76（B）培養(yǎng)48 h酪胺積累的影響Fig. 4 Effects of ferulic acid on accumulation of tyramine in E. faecalis XL-M66 (A) and E. faecium XL-M76 (B)

如圖4所示，在僅添加酪氨酸情況下，糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76在4～16 h均快速產(chǎn)生大量酪胺，20 h后酪胺產(chǎn)生速率明顯減慢，質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，最終分別達(dá)到227.0 μg/mL和216.6 μg/mL。這是因?yàn)榧?xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期代謝能力最強(qiáng)，能夠充分利用底物合成酪胺，而到達(dá)穩(wěn)定期后，由于培養(yǎng)基中前體物質(zhì)酪氨酸被大量消耗，質(zhì)量濃度降低，且酪氨酸脫羧酶的活性降低，所以酪胺的產(chǎn)生速率也隨之減慢。由空白組可以看出，糞腸球菌XL-M66在12 h內(nèi)未檢出酪胺，屎腸球菌XL-M76在16 h未檢出酪胺，48 h時(shí)2 株腸球菌酪胺質(zhì)量濃度分別為36.6 μg/mL和26.9 μg/mL。這是由于菌株在自身生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)利用外界營(yíng)養(yǎng)成分合成相應(yīng)的氨基酸，但因?yàn)樯L(zhǎng)初期培養(yǎng)液中菌落總數(shù)少，合成的氨基酸濃度較低，無(wú)法誘導(dǎo)tyrDC基因的表達(dá)[27]。

由酪氨酸＋阿魏酸組也可以看出，糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76的產(chǎn)酪胺能力隨著阿魏酸的添加均顯著降低（P＜0.05），較酪氨酸組酪胺質(zhì)量濃度分別減少了27.0%和19.9%。趙利利等[20]研究也發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以使大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)組胺質(zhì)量濃度降低18.45%和25.78%，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。阿魏酸不僅能夠抑制腸球菌的生長(zhǎng)，還會(huì)抑制操縱子tyrDC和tyrP轉(zhuǎn)錄，使酪氨酸脫羧酶質(zhì)量濃度降低，從而有效減少腸球菌酪胺的積累。

3 結(jié) 論

阿魏酸對(duì)糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76均具有顯著的抑制作用（P＜0.05），且對(duì)糞腸球菌XL-M66的抑制效果要強(qiáng)于屎腸球菌XL-M76。在不含酪氨酸底物情況下，阿魏酸對(duì)tyrDC和tyrP基因影響不大（P＞0.05），但可以促進(jìn)tyrS基因的表達(dá)；添加酪氨酸，使得整個(gè)酪胺合成TDC途徑被徹底激活，tyrDC和tyrP基因大量表達(dá)，此時(shí)添加阿魏酸能顯著抑制tyrDC、tyrP基因的表達(dá)（P＜0.05）。添加阿魏酸也能夠減慢2 株菌生長(zhǎng)過(guò)程中pH值的下降，并且使得糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76的酪胺產(chǎn)量分別降低27.0%和19.9%。因此，阿魏酸通過(guò)抑制糞腸球菌XL-M66和屎腸球菌XL-M76的數(shù)量、控制pH值降低以及tyrDC和tyrP基因的表達(dá)抑制酪胺的產(chǎn)生。