青錢柳黃酮對大豆油氧化的影響

郭彤彤，陳玉慧，張 鑫*，鄭曉杰

(1. 寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800； 2. 溫州科技職業(yè)學院，農業(yè)與生物技術學院，浙江 溫州 325006)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)系我國特有的胡桃科、青錢柳屬落葉喬木，又稱為青錢李、金錢柳、搖錢樹等，廣泛分布于我國南方地區(qū)。青錢柳具有清熱解暑、抗疲勞等多種功效，在我國作茶已有上千年歷史[1,2]。青錢柳提取物中不僅含有人體必需的鉀、鈣、鎂、磷等金屬元素，還富含各種具有保健功能的微量元素。此外，黃酮類化合物也是青錢柳中重要的成分，青錢柳黃酮結構復雜，表現(xiàn)出多種生理活性，具有抗炎殺菌、降血脂、降血糖、抗氧化及增強免疫力等藥理功能[3,4]，近年來已成為國內外的研究熱點。

大豆油是從大豆中壓榨提取出來的一種油，也稱為“大豆色拉油”，是我國主要食用油之一，含有較多亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸[5]，經常食用對于維護人體健康具有積極作用。然而大豆油的保質期較短，由于氧化酸敗，造成營養(yǎng)成分的破壞和營養(yǎng)價值的降低[6]。隨著現(xiàn)代食品加工方法的不斷發(fā)展，抗氧化劑所引起的健康問題受到人們的持續(xù)關注[7,8]。黃酮作為青錢柳中重要生物活性成分，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。作為一種高效、安全的天然抗氧化劑，將青錢柳黃酮應用于食用油脂及油基食品中，既可發(fā)揮抗氧化作用，又可保證食品安全。

本研究擬在實驗室之前的工作基礎上，利用大孔樹脂分離純化青錢柳黃酮，并通過研究青錢柳黃酮的體外抗氧化活性以及抑制大豆油氧化的活性，為青錢柳黃酮資源的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳由浙江省文成縣泉山中藥材種植有限公司提供，去除雜質和枝桿之后，粉碎備用。聚酰胺樹脂購于青島海洋化工有限公司； VE，上海阿拉丁試劑有限公司；DPPH和ABTS，Sigma公司；TPTZ，F(xiàn)luka公司；TBHQ，上海晶純試劑有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Laborota 4000真空旋轉蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；SHB-III型循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；冷凍干燥機，寧波新芝公司；AY-120電子精密天平，日本Shimadzu公司；電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫(yī)療機械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 青錢柳黃酮樣品的制備

稱取適量的粉碎青錢柳粉末，按照料液比1:20加入熱水，在60℃恒溫振蕩器中振蕩提取40 min，4500×g的條件下離心15 min得上清液，殘渣用同樣方法再次浸提，合并兩次上清液并濃縮、凍干，得到青錢柳黃酮粗提物。

將青錢柳黃酮粗提物制成2%質量分數(shù)的溶液，經0.45 μm濾膜過濾后上聚酰胺層析柱(30 cm×1.6 cm)。首先用水洗去水溶性雜質，洗脫流速為2.0 mL/min，洗脫2 BV(BV為柱床體積)后，用80%的乙醇洗脫，采用自動部分收集器收集洗脫液(10 mL/管)，濃縮、凍干，得到青錢柳黃酮樣品。

1.3.2 青錢柳黃酮含量的測定

標準曲線的繪制：精密稱取蘆丁標準品用80%乙醇定容，配成濃度0.4 mg/mL的蘆丁標準品溶液。配置不同濃度蘆丁標準品溶液1.0 mL分別置于10 mL試管中，分別加入50 mg/mL亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min后加入10 mg/mL硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min后加入40 mg/mL氫氧化鈉溶液4 mL，加水至刻度，混勻放置15 min。在509 nm波長范圍測定吸光度，以吸光度為橫坐標，蘆丁標準品濃度為縱坐標，繪制標準曲線[4]。稱取青錢柳黃酮樣品粉末溶于40%乙醇，按標準曲線中所述測定方法測定吸光度，根據回歸方程計算樣品中的總黃酮含量。

1.3.3 青錢柳黃酮體外抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH法抗氧化活性的測定

抗氧化能力的測定參照Liu等的方法[9]，稱取適量DPPH，以無水乙醇定容得0.1 mmol/L的溶液。取此溶液3 mL，加入不同質量濃度樣品液1 mL，室溫反應30 min，于517 nm 波長處測定吸光度，空白組以1 mL無水乙醇代替樣品液，并按下式計算清除率：

DPPH自由基清除率/% =

(1-A試樣/A空白) × 100%

注：A試樣為樣品的吸光度，A空白為空白組的吸光度。

1.3.3.2 TEAC法抗氧化活性的測定

TEAC法抗氧化活性的測定參照Stratil等的方法[10]。將7.0 mM ABTS與4.95 mM過硫酸鉀溶液等體積混合，于室溫、暗處反應12 h，形成藍綠色的ABTS+溶液，并將其734 nm處的光吸收值稀釋調整為1.3。以2.0 mM Trolox的磷酸鹽溶液作為標準貯液，用時稀釋，并做出反應標準曲線。

取3.9 mL ABTS+溶液與0.1 mL樣品液混合、搖勻，37℃水浴反應并計時，以磷酸鹽緩沖液調零，測定反應液在第10 min時734 nm處的吸光值Ai，同時測定3.9 mL ABTS+溶液與0.1 mL的磷酸鹽緩沖液的吸光光度值Ac，3.9 mL的磷酸鹽緩沖液與0.1 mL的樣品液吸光光度值Aj，計算吸光光度值減少度ΔA(ΔATrolox = (Ac- Ai) - Ai)，根據Trolox反應標準曲線計算TEAC值。

1.3.3.3 FRAP法抗氧化活性的測定

參照Benzie等的方法[11]，取0.2 mL樣品溶液加入3.0 mL FRAP試劑(由300 mM 醋酸鹽緩沖液300 mL、10 mM TPTZ溶液30 mL、20 mM FeCl3·6H2O溶液30 mL組成)，混勻后37℃反應10 min，測定593 nm處吸光值的增加，以1.0 mM FeSO4為對照，樣品抗氧化活性(FRAP值)以達到同樣吸光度所需FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

1.3.4 青錢柳黃酮對于大豆油抗氧化活性的測定

1.3.4.1 實驗樣品的處理

將不同質量青錢柳黃酮添加到大豆油中，青錢柳黃酮的終濃度分別為10-3mg/mL(CPF-low)，2.5×10-3mg/mL(CPF-middle)和5×10-2mg/mL(CPF-high)，同時將合成抗氧化劑TBHQ和BHT分別添加到大豆油中，終濃度均為10-3mg/mL。將樣品置于磁力攪拌器上25℃攪拌30 min，使抗氧化劑充分溶解在大豆油中。然后將所有樣品置于60℃烘箱，第3、6、9、12、15 d時測定過氧化值、共軛雙烯值和茴香胺值。在模擬烹飪過程中，將各樣品加熱至150℃維持5 min，分別測定過氧化值、共軛雙烯值和茴香胺值。

1.3.4.2 過氧化值的測定

參照李丹丹的方法[12]，準確稱取20 mg油樣，加0.5 mL氯仿-冰醋酸(V:V=2:3)溶解，加入0.05 mL碘化鉀飽和溶液，振蕩30 s后暗處放置3 min，取出加入顯色劑至10 mL，混勻后靜置5 min，在580 nm處測定其吸光度。

過氧化值= 6A/1000m×100×78.8

A：從標準曲線求得的樣品測定液的含碘量(μg)；m：樣品的質量(g)。

1.3.4.3 共軛雙烯值的測定

參照Wettasinghe和Shahidi的方法[13]，準確稱取20 mg油樣溶解于25 mL異辛烷中，混合均勻，測定其在234 nm處的吸光值，用異辛烷做空白。共軛雙烯值的計算采用下面的公式：

共軛雙烯值=234 nm處的吸光值/

(油的濃度 g/100 mL×比色杯的厚度)

1.3.4.4 茴香胺值的測定

參照我們之前建立的方法[7]，準確稱取2.0 g油樣，用異辛烷溶解并稀釋定容至25 mL成為未反應溶液，用異辛烷溶劑作參比，在350 nm處測定其吸光度A0。用移液管吸取未反應溶液5 mL置于10 mL試管中，加入1 mL p-茴香胺冰醋酸溶液，10 min后在350 nm處測定其吸光度A1。按下式計算：

茴香胺值= V/m × (1.2A1- A0)

V：溶解試樣的體積(mL)；m：試樣的質量(g)。

1.3.5 數(shù)據分析

所有實驗數(shù)據均測定3次取平均值，采用SPSS軟件(SPSS Inc.， Chicago，IL，USA)進行方差分析，P<0.05表示顯著差異。

2 結果與分析

2.1 青錢柳黃酮及三萜樣品的制備

青錢柳經熱水浸提，濃縮和冷凍干燥，得到黃酮粗提物。由于粗提物中含有一定量茶多糖等雜質，因此根據黃酮特性，選取聚酰胺樹脂，利用大孔樹脂柱層析法對其進行分離純化。經過聚酰胺大孔樹脂柱層析分離之后，青錢柳中黃酮的含量大于95%。

2.2 青錢柳黃酮體外抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH法測定青錢柳黃酮抗氧化活性

自由基具有高度的化學活性，是人體生命活動中多種生化反應的中間代謝物質。在正常情況下，機體內的自由基處于不斷產生與清除的動態(tài)平衡之中。自由基產生過多，就會通過攻擊生命大分子物質及各種細胞器，造成機體在分子、細胞及組織器官水平的各種損傷，加速機體衰老過程并誘發(fā)各種疾病[14]。

DPPH自由基是一種合成的有機自由基，常用來研究酚類抗氧化劑的構效關系。在有自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收消失，其退色程度與其接受的電子數(shù)成定量關系，因而可用分光光度計進行分析。樣品的DPPH自由基清除活性的結果如圖1(A)所示。樣品的DPPH自由基清除活性呈濃度依賴性變化。在樣品濃度為0.1 mg/m時，V和青錢柳黃酮的DPPH自由基清除活性分別為63.74%和35.33%。

2.2.2 TEAC法測定青錢柳黃酮抗氧化活性

TEAC法是以ABTS這種水溶性的自由基引發(fā)劑為顯色劑，ABTS經活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+，向其中加入被測物質。如果該物質中存在抗氧化成分，則該物質會與ABTS+發(fā)生反應而使反應體系褪色，引起734 nm吸光度的變化[15]。與含Trolox的對照標準體系比較，換算出被測物質總的抗氧化能力，結果表示為與一定量提取物具有相同抗氧化活性的Trolox的濃度。因此也把該方法稱為TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC)法。與樣品的ABTS+·自由基清除活性的結果如圖1(B)所示，樣品對ABTS+·的清除活性呈濃度依賴性變化，同時VE和青錢柳黃酮清除ABTS+·自由基的IC50值分別為0.028 mg/mL和0.078 mg/mL。

2.2.3 FRAP法測定青錢柳黃酮抗氧化活性

FRAP法的原理為Fe3+-TPTZ可被樣品中還原物質還原為Fe2+-TPTZ，溶液變成深藍色，并于593 nm處具有最大吸收值，根據吸光度的大小計算樣品抗氧化活性的強弱[16]。在還原體系中，各樣品對于Fe3+均有一定的還原能力，且還原能力隨濃度的升高而增強(圖1C)。在相同濃度下，VE的Fe3+還原能力強于青錢柳黃酮，但是青錢柳黃酮同樣具有較強的抗氧化活性。

圖1 通過DPPH法(A)、ABTS法(B)及FRAP法(C)測定青錢柳黃酮的抗氧化活性Fig. 1 Antioxidant activities of C. paliurus flavonoids determined by DPPH free radical-scavenging assay (A), ABTS assay (B), and FRAP assay (C).

2.3 青錢柳黃酮對大豆油抗氧化活性研究

2.3.1 不同抗氧化劑對大豆油過氧化值的影響

油脂氧化是引起油脂酸敗的主要原因之一，油脂不飽和脂肪酸在氧化過程中過氧化物的形成使過氧化值升高。從圖2A中可以看出，TBHQ抑制大豆油生成過氧化物的作用最強，而制備得到的青錢柳黃酮對大豆油同樣具有較強的抗氧化作用，且存在劑量依賴關系。隨著青錢柳黃酮含量的升高，大豆油的過氧化值下降，說明其抑制大豆油生成過氧化物的能力也加強。從圖2B中可以看出，在經過高溫150℃處理5 min后，各樣品的過氧化值均顯著上升，在此模擬烹飪過程中，與模擬貯藏過程的結果類似，TBHQ抑制大豆油生成過氧化物的作用最強，同時，青錢柳黃酮對于抑制大豆油高溫烹飪過程的氧化，也發(fā)揮了積極作用，而且存在劑量依賴關系，在添加大豆油青錢柳黃酮的樣品中，過氧化值均顯著低于空白對照(P<0.05)。

2.3.2 不同抗氧化劑對大豆油共軛雙烯值的影響

共軛雙烯值反映不飽和脂肪酸氧化初始形成的共軛雙鍵的數(shù)量。由圖2C可以看出，用青錢柳黃酮和人工合成抗氧化劑TBHQ處理過的大豆油中，共軛雙烯值明顯降低。隨著青錢柳黃酮含量的增加，其抑制大豆油生成過共軛雙鍵的能力越來越強。在實驗選取的濃度范圍內，青錢柳黃酮抑制大豆油生成過共軛雙鍵的能力均小TBHQ(P<0.05)，結果表明青錢柳黃酮具有較強抑制大豆油生成過共軛雙鍵的能力，即具有較強的抑制大豆油氧化的能力。在經過高溫150℃處理5 min后，各樣品的共軛雙烯值均顯著上升，如圖2D所示。青錢柳黃酮抑制大豆油生成過共軛雙鍵的能力顯著高于空白對照(P<0.05)，且存在劑量依賴關系，說明青錢柳黃酮在高溫烹飪條件下顯著抑制了大豆油的氧化。

2.3.3 不同抗氧化劑對大豆油茴香胺值的影響

大豆油中醛類化合物的含量，可以用茴香胺值表示，其數(shù)值越大，油脂的劣變程度越嚴重。新鮮的精煉油茴香胺值很低，當食用油脂儲藏不當，茴香胺值則顯著上升。

由圖2E可以看出，茴香胺值隨著大豆油儲存時間的延長而增大。合成抗氧化劑TBHQ抑制大豆油氧化的效果最好，同時青錢柳黃酮的作用具有劑量效應關系，隨著劑量的增大，大豆油茴香胺值相對下降，說明青錢柳黃酮有效抑制了大豆油在貯藏過程中的劣變。從圖2F中可以看出，在模擬高溫烹飪過程150℃處理5 min后，各樣品的茴香胺值均顯著上升。有研究報道，雖然茴香胺值作為控制植物油常溫儲存的品質變化的指標并不敏感，但可以作為高溫儲存或煎炸過程中檢驗油脂品質的指標[12]。在本實驗中，TBHQ顯著抑制了大豆油茴香胺值的升高，同時青錢柳黃酮對于抑制大豆油茴香胺值升高的能力顯著高于空白對照(P< 0.05)，而且存在劑量依賴關系，說明青錢柳黃酮在高溫烹飪過程中，能夠有效防止油脂品質的劣變。

圖2 添加青錢柳黃酮與TBHQ的大豆油中貯藏過程過氧化值(A)、烹飪過程過氧化值(B)、貯藏過程共軛雙烯值(C)、烹飪過程共軛雙烯值(D)、貯藏過程茴香胺值(E)和烹飪過程茴香胺值(F)的比較Fig. 2 Comparison of the addition of C. paliurus flavonoids and TBHQin soybean oil with respect to peroxide value in storage (A) and cooking process (B), diene value in storage (C) and cooking process (D), anisidine value in storage (E) and cooking process (F).

3 結論

大豆油中的不飽和脂肪酸易與空氣中的氧氣發(fā)生反應，進行氧化和分解，產生強烈刺激性氣味，生成過氧化脂質，即為“酸敗”[17]。由于大豆油中不飽和脂肪酸的含量相對較高，加工及貯藏過程中如何降低不飽和脂肪酸的氧化程度，值得關注。氧化酸敗的大豆油不僅營養(yǎng)素被破壞，同時還會產生異味及有毒有害物質，危害食用者身體健康。防止發(fā)生氧化酸敗，保證食用油質量安全成為食用油生產及儲藏中的關鍵問題。

除了精加工、密封、充氮包裝外，添加抗氧化劑是儲藏食用油簡單、經濟的方法[18]?？寡趸瘎┛梢苑譃楹铣煽寡趸瘎┖吞烊豢寡趸瘎壳笆称饭I(yè)一直采用添加人工合成抗氧化抑制油脂在加工與儲存期間發(fā)生的氧化反應，它們對防止食用油氧化酸敗具有較好效果。但動物試驗表明，BHT(Butylated hydroxytoluene，BHT)和TBHQ均有一定毒性和致癌作用[19]，再加上人們對合成食品添加劑的懷疑和排斥心理，這些合成抗氧化劑的使用受到限制，所以安全性高、抗氧化能力強、無毒副作用的天然抗氧化劑日益受到關注。天然抗氧化劑在油脂保護中的應用也成為油脂化學的研究熱點，有報道表明，植物多酚提取物具有顯著的保護植物油過氧化的作用[20,21]。

作為天然抗氧化劑，青錢柳黃酮具有安全、高效、無毒等特點，同時又具有抗炎、殺菌、抗病毒、降血脂、降血糖及抗氧化等多種生理功能，不僅能有效減緩食用大豆油氧化酸敗，延長其貯藏期限，而且可以預防人體多種疾病，提升人體健康狀態(tài)，同時避免了合成抗氧化劑所帶來的食品安全問題。因此，以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑將會是今后食用油產業(yè)發(fā)展的大趨勢。本實驗以中國特產青錢柳為原料，制備得到了高純度的青錢柳黃酮。體外抗氧化實驗結果表明，青錢柳黃酮具有較強的體外抗氧化活性；在貯藏及高溫烹飪時，青錢柳黃酮能夠較為明顯的抑制大豆油氧化。在高度重視發(fā)展天然抗氧化劑的當今，在油脂行業(yè)開發(fā)應用這種具有保健功能的青錢柳黃酮資源，具有重要理論價值。