血清4型禽腺病毒浙江株的分離鑒定及其全基因組序列分析

李夏，夏文君，毛鍶超，盧舒婷，莫開(kāi)昆，廖敏，周繼勇，鄭肖娟

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058）

禽腺病毒（fowl adenovirus, FAdV）是腺病毒科腺病毒屬的一員。目前，F(xiàn)AdV可分為5類（A～E）共12種血清型（1～7、8a、8b、9～11）[1-2]。血清4型禽腺病毒（FAdV4）感染引起包涵體肝炎-心包積液綜合征（hydropericardium hepatitis syndrome, HHS）。該病于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)被首次報(bào)道，因此，又被稱為安卡拉病[3]。2010年以前，F(xiàn)AdV4在我國(guó)沒(méi)有形成較大的流行趨勢(shì)，但自2015年夏季開(kāi)始在我國(guó)東南沿海地區(qū)大肆爆發(fā)[4]，加拿大、日本、印度、波蘭等一些國(guó)家也陸續(xù)爆發(fā)該病[5-6]。其典型致病特征是心臟腫脹、出血，心包腔內(nèi)有大量淡黃色透明液體，肝腫大、出血，且呈淺褐色[7-8]；該病潛伏期短，發(fā)病快，死亡率高，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為威脅我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的重大疫病之一。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)血清4 型禽腺病毒的研究主要集中在分離鑒定[9-10]、基因序列分析、疫苗研制[11-12]和致病性[13-14]分析等方面。楊曉偉等分離出一株FAdV4山東株，并制備出對(duì)FAdV4感染具有良好防治效果的卵黃抗體[15]。梁廣成對(duì)FAdV4 分離株的全基因組及致病性進(jìn)行了研究，并初步建立了抗體間接免疫熒光方法[16]。劉延珂等研究發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)在中國(guó)流行的高致病性FAdV4 毒株能夠在雞肝癌細(xì)胞系LMH 中很好增殖，并且不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度與病毒基因組拷貝數(shù)呈正相關(guān)[17]。WANG 等制備出具有良好中和活性的Fiber-2 蛋白的單克隆抗體[18]。另有報(bào)道稱，基于Fiber-2蛋白的亞單位疫苗可提供比滅活油乳劑疫苗更快更強(qiáng)的免疫保護(hù)能力[19]。GUAN 等對(duì)FAdV4 四川分離株的全基因組及hexon 基因進(jìn)行了遺傳分析，揭示了其ORF29開(kāi)放閱讀框的缺失，為近年來(lái)FAdV4毒力的增強(qiáng)提供了一定的理論猜想[20]。本實(shí)驗(yàn)從2015 年浙江省某雞場(chǎng)爆發(fā)的出現(xiàn)HHS 典型癥狀的肝組織中成功分離到FAdV4 浙江株，并對(duì)其全基因組、hexon 和fiber-2 基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，為進(jìn)一步研究FAdV4的流行特點(diǎn)及毒力變異機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

UNIQ-10 柱式病毒基因組抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRI201 LS 購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司，KOD-Plus-Neo 高保真DNA 聚合酶購(gòu)自上海碩盟生物科技有限公司，Taq酶、100 bp DNA梯狀標(biāo)志物和1 kb DNA分子標(biāo)志物購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司，2×Taq Plus 反應(yīng)混合物購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，DNA清潔回收試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司，pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，SPF 雞胚購(gòu)自浙江寧波純派農(nóng)業(yè)科技有限公司，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司，β-actin 單抗購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG 均購(gòu)自美國(guó)KPL 公司，NDV-Lasota 疫苗毒株購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司，禽腺病毒Hexon和Fiber-2鼠多抗血清由本實(shí)驗(yàn)室制備、保存。

1.2 病料采集與處理

將2015 年浙江某雞場(chǎng)疑似HHS 的病死雞肝剪碎后充分研磨，用滅菌生理鹽水按體積比1∶3稀釋，加入終濃度為1 000 U/mL 的青鏈霉素，反復(fù)凍融3次，于4 ℃、1.2×104r/min條件下離心10 min，取上清液，并進(jìn)行過(guò)濾除菌，分裝后置于-80 ℃冰箱凍存。

1.3 病毒懸液的核酸提取和檢測(cè)

按照UNIQ-10 柱式病毒基因組抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒DNA的抽提，利用Trizol法提取病毒懸液中的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min，42 ℃延伸60 min，72 ℃失活10 min。根據(jù)GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）發(fā)表的FAdV4的hexon基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)1 對(duì)FAdV4 的檢測(cè)引物，同時(shí)根據(jù)其他常見(jiàn)禽病病原相關(guān)基因的保守序列（AIV/M、IBDV/VP2、NDV/NP、IBV/S1、MDV/132 bp 重復(fù)區(qū)域、EDSV/100 kDa）設(shè)計(jì)用于多種禽病病原排除檢測(cè)的引物對(duì)（表1）。以提取的DNA 或反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，利用表1 所示的檢測(cè)引物，以2×Taq Plus 反應(yīng)混合物擴(kuò)增目的基因。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）體系為：2×Taq Plus反應(yīng)混合物12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR/反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 雞常見(jiàn)病原的鑒別檢測(cè)引物Table 1 Detection primers for common pathogens in chickens

1.4 病毒在雞胚及雞胚腎細(xì)胞中的傳代培養(yǎng)

將經(jīng)研磨處理的肝上清液通過(guò)尿囊腔注射法接種于10 日齡SPF 雞胚中，0.2 mL/枚，然后置于37 ℃環(huán)境下孵育，每日觀察，收集接種后5 d內(nèi)雞胚尿囊液和胚體，剖檢并觀察胚體的病理變化，對(duì)收集的雞胚尿囊液進(jìn)行病毒核酸的檢測(cè)鑒定。取17～20 日齡SPF 雞胚腎組織，參照繆從容等[21]的方法制備新鮮的原代雞胚腎（chicken embryo kidney,CEK）細(xì)胞，并根據(jù)CEK細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)多呈上皮樣等特性，在接毒前多次換液以去除不貼壁的細(xì)胞，獲得純度較高的CEK細(xì)胞。將雞胚上傳至第3 代的尿囊液接種CEK 細(xì)胞后進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞連續(xù)傳代，傳至11 代后，收集細(xì)胞毒進(jìn)行病毒檢測(cè)和鑒定。

1.5 血凝實(shí)驗(yàn)

在常溫下，將收集到的尿囊液及細(xì)胞適應(yīng)病毒的懸液用生理鹽水進(jìn)行2的倍比稀釋，然后加入1%的雞、小鼠、大鼠、綿羊等多種動(dòng)物的紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝（hemagglutination,HA）實(shí)驗(yàn)，以NDV-Lasota疫苗株作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察尿囊液和細(xì)胞毒能否對(duì)各種動(dòng)物紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。

1.6 病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定

在半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50% tissue culture infective dose,TCID50）測(cè)定前一天制備CEK 細(xì)胞，并鋪于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔；在進(jìn)行TCID50測(cè)定當(dāng)天換液。將病毒用DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋（從10-1稀釋到10-11），將稀釋后的病毒接種CEK 細(xì)胞，每孔50μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔。在接毒后48 h，用細(xì)胞固定液將細(xì)胞固定，以Fiber-2 蛋白的多抗血清作為一抗，以FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 作為二抗，對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察Fiber-2 陽(yáng)性細(xì)胞，按Reed-Muench法[22]計(jì)算病毒的TCID50。

1.7 雞胚致病性實(shí)驗(yàn)及接毒雞胚肝組織中Fiber-2蛋白的檢測(cè)

將60枚10日齡SPF雞胚平均分成6組，第1-5組分別以尿囊腔注射法接種FAdV4-ZJ2015的第3、7、8、9、11代細(xì)胞毒，接種劑量為0.2 mL/枚，第6組不接種病毒，為空白對(duì)照組。將雞胚置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，棄去24 h內(nèi)非正常死亡雞胚。逐日觀察接毒、未接毒雞胚有無(wú)死胚、弱胚現(xiàn)象，計(jì)算各組雞胚孵化率與死亡率，剖檢死亡雞胚和對(duì)照雞胚，觀察其肝、心等組織病變情況。每組取1 g雞胚肝組織，剪碎、研磨，取等量組織研磨液，以實(shí)驗(yàn)室前期制備的Fiber-2多抗血清（體積比1∶1 000）作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（體積比1∶3 000）作為二抗，利用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）特異性檢測(cè)肝組織中病毒蛋白Fiber-2的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。

1.8 病毒全基因組測(cè)序及序列分析

參照FAdV4-JSJ13（KM096544.1）毒株的全基因組測(cè)序引物[23]，并避開(kāi)FAdV4 流行毒株可能存在的大段缺失位置，本文設(shè)計(jì)了分段PCR法擴(kuò)增FAdV4全基因組的11 對(duì)引物（表2），并確保相鄰的2 對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物之間有部分重疊區(qū)域。引物由擎科生物（杭州）股份有限公司合成。以抽提的病毒基因組DNA 為模板，利用表2 所列11 對(duì)擴(kuò)增引物，采用KOD-Plus-Neo 熱啟動(dòng)高保真DNA 聚合酶，參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上的PCR 擴(kuò)增體系分別擴(kuò)增跨越FAdV4全基因組的11個(gè)目的基因片段，經(jīng)Taq酶加A尾后，將其連接到pMD18-T載體上，經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的重組菌液送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序。將測(cè)得的11 個(gè)片段序列用NCBI 在線軟件BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)其同源性，再用DNAman軟件的Multiple Sequence Assembly功能對(duì)片段進(jìn)行拼接，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行人工校正。利用MegAlign 軟件的View/Sequence distance 功能對(duì)ZJ2015 與FAdV4 其他毒株的全基因組同源性進(jìn)行比對(duì)分析，利用Mega 6.06 軟件中的Clustal W 程序分別完成ZJ2015 全基因組及hexon、fiber-2 基因序列的完全比對(duì)，并采用鄰接法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，用最大似然復(fù)合（maximum composite likelihood）模型進(jìn)行比對(duì)，自舉值（bootstrap value）設(shè)置為1 000。

表2 跨越FAdV4-ZJ2015株全基因組的11個(gè)片段的擴(kuò)增引物Table 2 Primers to amplify 11 fragments covering the whole genome of FAdV4-ZJ2015 strain

2 結(jié)果與分析

2.1 HHS 發(fā)病雞的病原鑒定

將2015 年浙江省某雞場(chǎng)出現(xiàn)典型HHS 的發(fā)病雞肝組織研磨處理后，取上清懸液接種于雞胚并進(jìn)行連續(xù)傳代。以表1列出的檢測(cè)引物，采用PCR/反轉(zhuǎn)錄-PCR方法對(duì)肝組織處理上清液和第1—3代雞胚尿囊液進(jìn)行常見(jiàn)禽病病毒鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV 引物擴(kuò)增獲得一條大小約900 bp 的條帶，與預(yù)期的FAdV 目的條帶大小相符（圖1A～B），但沒(méi)有檢測(cè)到傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）、禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、減蛋綜合征病毒（egg drop syndrome virus, EDSV）、馬立克病毒（Marek’s disease virus,MDV）及傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）等常見(jiàn)禽病病原的擴(kuò)增條帶（圖1C～D）。將擴(kuò)增到的FAdV 片段測(cè)序分析顯示，該序列與FAdV4 的hexon 基因同源性高達(dá)100%，初步證明該浙江雞場(chǎng)感染的病原是FAdV4型，命名為ZJ2015。

2.2 FAdV4 的分離和細(xì)胞適應(yīng)性分析

圖1 肝組織及雞胚尿囊液中病毒核酸的鑒別檢測(cè)Fig.1 Identification of viral nucleic acids in liver tissues and allantoic fluid of chicken embryos

將PCR檢測(cè)為腺病毒陽(yáng)性的雞胚尿囊液第3代毒接種CEK細(xì)胞，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)。為了進(jìn)一步分析病毒是否在CEK細(xì)胞中復(fù)制增殖，利用本實(shí)驗(yàn)室制備的Fiber-2 和Hexon 蛋白的陽(yáng)性血清對(duì)FAdV4-ZJ2015感染細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示，F(xiàn)iber-2 和Hexon 蛋白陽(yáng)性血清在FAdV4-ZJ2015感染的CEK細(xì)胞中均檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞（圖2），說(shuō)明FAdV4-ZJ2015 已適應(yīng)在CEK 細(xì)胞上復(fù)制。將ZJ2015在CEK細(xì)胞上連續(xù)傳代至11代（P11），進(jìn)一步經(jīng)PCR/反轉(zhuǎn)錄-PCR對(duì)病毒核酸進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV4 核酸穩(wěn)定存在，沒(méi)有檢測(cè)到IBV、AIV、NDV、EDSV、MDV 及IBDV 的病毒核酸。

圖2 FAdV4-ZJ2015感染CEK細(xì)胞的間接免疫熒光檢測(cè)Fig.2 Indirect immunofluorescence assay of CEK cells infected with FAdV4-ZJ2015 strain

2.3 血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將雞胚傳至3 代的尿囊液和在CEK 細(xì)胞上傳至11代的細(xì)胞上清液分別與雞、小鼠、大鼠、綿羊的紅細(xì)胞進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，以NDV-Lasota 疫苗毒株作為血凝實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，分離的FAdV4-ZJ2015 毒株不具有凝集雞、小鼠、大鼠、綿羊紅細(xì)胞的能力。

2.4 病毒滴度TCID50測(cè)定結(jié)果

將ZJ2015 株第11 代細(xì)胞適應(yīng)毒倍比（10-1、10-2、10-3……）稀釋后，接種到原代CEK細(xì)胞上，在感染后48 h固定細(xì)胞，利用Fiber-2鼠多抗血清進(jìn)行間接免疫熒光法檢測(cè)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)Reed-Muench 公式計(jì)算ZJ2015 毒株第11代細(xì)胞適應(yīng)毒的TCID50為2.0×106mL-1。

2.5 FAdV4-ZJ2015 的雞胚致病性

為了進(jìn)一步分析FAdV4-ZJ2015毒株的雞胚致病性，將第3、7、8、9、11 代的ZJ2015 分離毒接種于10 日齡SPF 雞胚（0.2 mL/枚）中，每天觀察死胚、弱胚現(xiàn)象。結(jié)果表明：接種7 d內(nèi)，無(wú)死胚現(xiàn)象；第8天血管明顯減弱，開(kāi)始出現(xiàn)雞胚死亡；統(tǒng)計(jì)至第21天，陰性雞胚孵化率為90%，死亡率10%，接毒雞胚孵化率為0，死亡率為100%。對(duì)死亡雞胚剖檢發(fā)現(xiàn)，接毒組雞胚較陰性組雞胚個(gè)頭明顯偏小（圖3A-a、3A-b），且接毒組雞胚心臟腫大、出血，但心包積液現(xiàn)象不明顯，肝腫脹、出血（圖3A-c、圖3A-d）。將ZJ2015的不同代次（P3、P7、P8、P9和P11）分離毒接種雞胚后的肝組織研磨，用Fiber-2多抗檢測(cè)肝中病毒蛋白Fiber-2的表達(dá)。結(jié)果顯示，不同代次分離毒均能成功感染雞胚的肝組織，而未接毒雞胚的肝研磨液無(wú)Fiber-2蛋白的表達(dá)（圖3B）。

2.6 FAdV4 全基因組的分段擴(kuò)增和序列測(cè)定

抽提FAdV4-ZJ2015接種雞胚尿囊液中的病毒基因組DNA，以設(shè)計(jì)合成的11 對(duì)引物（表2），采用分段擴(kuò)增法成功擴(kuò)增到跨越ZJ2015 毒株FAdV4 的全基因組的11個(gè)片段（圖4），擴(kuò)增的目的基因大小范圍為3.6～5.9 kb。將測(cè)得的11個(gè)片段連接pMD18-T載體后測(cè)序，獲得的序列信息經(jīng)比對(duì)后進(jìn)行序列拼接，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行多次校正，最終得到全長(zhǎng)43 717 bp的禽腺病毒4型分離株（ZJ2015）的全基因組序列（GenBank登錄號(hào)：MF521611.1）。

2.7 FAdV4 全基因組遺傳進(jìn)化分析

圖3 FAdV4-ZJ2015株的雞胚致病性實(shí)驗(yàn)和肝組織中Fiber-2蛋白的表達(dá)Fig.3 Pathogenicity of FAdV4-ZJ2015 strain on chicken embryo and expression of Fiber-2 protein in the liver tissues

圖4 分段PCR 擴(kuò)增法對(duì)FAdV4-ZJ2015 全基因組的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification result of the whole genome of FAdV4-ZJ2015 by segmented PCR amplification

利用Mega 6.06 將ZJ2015 全基因組（全長(zhǎng)43 717 bp，GC 含量54.87%）與不同血清型FAdV 毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：ZJ2015毒株處于C型FAdV分支上；在這個(gè)分支內(nèi)，ZJ2015與近年來(lái)我國(guó)分離到的FAdV4型毒株親緣關(guān)系更近，而與加拿大ON1（GU188428.1）、日本KR5（HE608152.1）、墨西哥MX-SHP95（KP295475.1）毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。用MegAlign 比對(duì)ZJ2015 與FAdV4 國(guó)外經(jīng)典毒株及國(guó)內(nèi)流行毒株的同源性顯示，ZJ2015株與2015 年以來(lái)國(guó)內(nèi)流行的高致病力毒株的同源性在99.87%以上，與國(guó)外經(jīng)典毒株略有差異，同源性在98.2%～99.0%之間（表3）。核酸序列分析顯示，與國(guó)外毒株相比，ZJ2015及近年流行的FAdV4毒株的GA和TC重復(fù)區(qū)出現(xiàn)不同程度的缺失，且在基因組3.5×104～4.0×104bp 位置處有一段長(zhǎng)1 966 bp 的基因片段缺失突變，這導(dǎo)致基因組中ORF19、ORF27、ORF48這3個(gè)編碼蛋白的缺失。

2.8 基于Hexon 和Fiber-2 蛋白的遺傳進(jìn)化分析

hexon基因高度保守，能很好地顯示禽腺病毒的分型特征。ZJ2015毒株的hexon基因全長(zhǎng)2 814 bp，編碼937個(gè)氨基酸。基于氨基酸水平的遺傳進(jìn)化分析顯示：ZJ2015毒株與國(guó)內(nèi)流行毒株同屬FAdV4型；與墨西哥、日本、加拿大毒株有一定差異，屬于2個(gè)不同的分支（圖6A）。ZJ2015毒株的hexon編碼937個(gè)氨基酸，與國(guó)內(nèi)多數(shù)毒株相同；而韓國(guó)株Kr-Yeoju（ADV35558.1）的hexon 編碼936 個(gè)氨基酸，表現(xiàn)在第196 位氨基酸缺失。中國(guó)毒株與印度B1-7（ANG08820.1）、日本KR5（CCE39367.1）和加拿大ON1（ADQ39061.1）毒株相比，第189 位氨基酸由Ⅰ突變成R，第196位氨基酸由E突變成Q，而這一現(xiàn)象在我國(guó)近年來(lái)流行的FAdV4毒株中均可發(fā)現(xiàn)。

圖5 基于ZJ2015全基因組核苷酸水平的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis based on the whole genome of ZJ2015 strain

表3 基于ZJ2015全基因組核苷酸水平的同源性比對(duì)Table 3 Homology alignment based on the whole genome of ZJ2015 strain

圖6 基于Hexon（A）和Fiber-2（B）蛋白的氨基酸水平系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis based on amino acid levels of Hexon(A)and Fiber-2(B)proteins

fiber-2基因位于病毒粒子的五鄰體上，存在型和亞屬特異性抗原表位，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。ZJ2015 毒株的fiber-2 基因全長(zhǎng)1 440 bp，編碼479 個(gè)氨基酸。氨基酸水平的遺傳進(jìn)化分析（圖6B）顯示：包括ZJ2015 株在內(nèi)的國(guó)內(nèi)流行毒株與巴基斯坦、科威特和印度毒株親緣關(guān)系較近；另外，韓國(guó)、澳大利亞和墨西哥毒株親緣關(guān)系較近，秘魯、厄瓜多爾和智利毒株親緣關(guān)系較近，分屬于同一大簇，早期日本、加拿大和德國(guó)毒株則處在另一簇，與近年出現(xiàn)的毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；趂iber-2基因氨基酸水平突變位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，ZJ2015毒株的11～16 位為ENGKPE，與國(guó)內(nèi)毒株相同，但與ON1（GU188428）、KR5（FR872912）和MXSHP95（KP295475）毒株相比則出現(xiàn)了不同程度的插入和突變；同時(shí)，比對(duì)發(fā)現(xiàn)ZJ2015毒株在219位由G突變?yōu)镈，在232位由E突變?yōu)镼，在319位由V突變?yōu)镮，這些突變?cè)趪?guó)內(nèi)流行毒株中均有發(fā)生，且這些突變毒株均為高致病性毒株。此外，ZJ2015毒株也發(fā)生了一些在其他位置上的突變（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2019.03.041）。

3 討論

自2015 年以來(lái)，在中國(guó)多個(gè)地區(qū)爆發(fā)以HHS為典型特征的FAdV4感染。隨后，有多個(gè)研究機(jī)構(gòu)采用雞胚接種、原代雞胚肝細(xì)胞（CEL）、原代CEK細(xì)胞或雞肝癌細(xì)胞系LMH 培養(yǎng)等途徑，從山東[16]、河南[13]、北京[24]、廣西[25]、江蘇[23]、陜西[26]、四川[14]、遼寧[27]等地成功分離到FAdV4的流行毒株，但尚未有浙江省FAdV4 毒株分離鑒定的研究報(bào)道。本研究對(duì)2015 年浙江省某雞場(chǎng)剖檢可見(jiàn)明顯的膠凍樣心包積液、肝壞死等病理變化的病死雞肝進(jìn)行病毒檢測(cè)，因其在雞胚傳至第1、2、3 代時(shí)雖然均能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，但傳至第4 代時(shí)就檢測(cè)不到目的基因的表達(dá)，后優(yōu)化方法改用雞胚傳至第3 代的尿囊液接種原代CEK 細(xì)胞至11 代，發(fā)現(xiàn)接種CEK 細(xì)胞后的每一代均能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，因此我們采用雞胚接種結(jié)合原代CEK 細(xì)胞連續(xù)傳代的方法，成功分離到一株FAdV4 浙江株ZJ2015，該毒株的基因組序列與近年流行的毒力增強(qiáng)的FAdV4 毒株序列很相近。該毒株可以在CEK 細(xì)胞上穩(wěn)定培養(yǎng)，TCID50達(dá)到2.0×106mL-1以上，雖然沒(méi)有呈現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，但可以通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室制備的Fiber-2 和Hexon 多抗血清進(jìn)行間接免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)來(lái)檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)情況。這一毒株的分離，為后續(xù)開(kāi)展FAdV4 的診斷和防控技術(shù)、疫苗開(kāi)發(fā)及毒力變異機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

FAdV基因組全長(zhǎng)大于43 kb，自2015年全國(guó)各地爆發(fā)FAdV4 以來(lái)，雖然有較多的毒株分離出來(lái)，但只有部分毒株如HLJFAD15（KU991797.1）、JSJ13（KM096544.1）、HB1510（KU587519.1）等（附表2 http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2019.03.041）獲得了全基因組序列信息。這些全基因組序列大多采用小片段擴(kuò)增結(jié)合正反向測(cè)序的方法[16,23]。本研究擴(kuò)增ZJ2015毒株全基因組片段時(shí)，采用高保真酶結(jié)合長(zhǎng)距離PCR 擴(kuò)增法，分11段擴(kuò)增獲得跨越全基因組的片段，每個(gè)片段都有3.6～6.0 kb。雖然連接到pMD18-T 載體的效率相對(duì)低一些，但與39 段擴(kuò)增法[23]相比，顯著減少了pMD18-T 載體連接的后續(xù)鑒定和序列拼接的工作量，為之后反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

與國(guó)外FAdV4 毒株如加拿大分離株ON1（GU188428.1）、日本分離株KR5（HE608152.1）和墨西哥分離株MX-SHP95（KP295475.1）相比，ZJ2015毒株和國(guó)內(nèi)流行的FAdV4毒株中均有一段長(zhǎng)為1 966 bp的缺失，LI等推測(cè)該段缺失可能與近年國(guó)內(nèi)流行毒株的毒力增強(qiáng)有關(guān)[28]，而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，近年國(guó)內(nèi)流行毒株的毒力增強(qiáng)與這段缺失沒(méi)有關(guān)系[29]，而是與Hexon和Fiber-2蛋白有關(guān)[30]。Hexon蛋白是腺病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，與國(guó)外ON1（ADQ39061.1）、KR5（CCE39367.1）和MX-SHP95（AKN35186.1）毒株相比，中國(guó)株的JSJ13（AIS19793.1）和HB1503（KX421402.1）的hexon 基因編碼701 個(gè)氨基酸，ZJ2015 編碼937 個(gè)氨基酸，且第189、196 位氨基酸發(fā)生突變，這些突變均發(fā)生在高致病性毒株中，也可能與近年來(lái)國(guó)內(nèi)流行毒株的毒力增強(qiáng)有關(guān)[30]。Fiber蛋白位于病毒粒子表面，對(duì)病毒感染宿主具有重要作用。FAdV-A和FAdV-C的fiber基因能夠編碼Fiber-1和Fiber-2這2個(gè)蛋白，其他型的FAdV只編碼一個(gè)Fiber蛋白。Fiber-2蛋白因其位于五鄰體頭節(jié)區(qū)，易發(fā)生突變（附表1），目前這些突變位點(diǎn)自2015 年以來(lái)在FAdV4 流行毒株毒力變異中的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，有必要建立有效的反向遺傳系統(tǒng)，并制備特異的Hexon和Fiber-2單克隆抗體，為后續(xù)的毒力變異的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。