精胺對(duì)鵝免疫器官指數(shù)及免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響

易治鑫，蔣易龍，王秋宏，徐麒麟，王新興，莫桂林，姜冬梅，康波*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都611130；2.巴中市農(nóng)林科學(xué)研究院，四川 巴中636000；3.成都市農(nóng)林科學(xué)院，成都611130）

多胺（主要包括腐胺、亞精胺和精胺）能作為內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，精胺作為內(nèi)源性細(xì)胞因子抑制劑，能抑制白細(xì)胞介素-1（interleukin-1, IL-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的合成[3-5]。HASKó 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，精胺不僅能抑制脾細(xì)胞釋放γ-干擾素（interferon-γ,IFN-γ），還能抑制巨噬細(xì)胞翻譯白細(xì)胞介素-12（interleukin-12, IL-12），進(jìn)而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。CAO 等[6]通過(guò)在仔豬日糧中添加0.4 mmol/kg 精胺發(fā)現(xiàn)，精胺不僅能顯著抑制胸腺和脾中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)，同時(shí)還能顯著提高IgM、IL-10 及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 基因的表達(dá)。該結(jié)果提示精胺能介導(dǎo)免疫相關(guān)因子基因的表達(dá)，從而影響機(jī)體正常生理狀態(tài)下的免疫功能。此外，當(dāng)母乳中精胺濃度低于2 nmol/L 時(shí)，80%的新生兒會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)；而精胺濃度在13 nmol/L 以上時(shí)，過(guò)敏癥狀發(fā)生概率將顯著降低[7]。這說(shuō)明精胺對(duì)幼齡動(dòng)物的免疫能力具有調(diào)控作用。綜上所述，精胺能介導(dǎo)免疫因子參與的機(jī)體免疫調(diào)控。

胸腺、脾和法氏囊作為禽類重要的免疫器官，是產(chǎn)生免疫細(xì)胞和免疫因子的主要場(chǎng)所[8]；肝不僅能參與代謝和解毒，在禽類免疫功能中也具有十分重要的作用。我們的前期研究表明，精胺可通過(guò)介導(dǎo)鵝卵泡顆粒細(xì)胞雌激素受體和促黃體激素受體基因表達(dá)來(lái)參與調(diào)控雌鵝卵巢功能[9-10]。然而，目前尚未見精胺對(duì)雌鵝免疫器官指數(shù)和免疫相關(guān)因子基因表達(dá)影響的研究報(bào)道。因此，本研究用不同濃度精胺灌喂四川白鵝雌鵝2 周后，測(cè)定肝、胸腺、脾和法氏囊的免疫器官指數(shù)，并定量檢測(cè)肝、胸腺、脾和法氏囊組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因的表達(dá)量，以明確外源性精胺對(duì)雌鵝免疫器官指數(shù)和免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響，為探究精胺調(diào)控家禽免疫功能的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

隨機(jī)選取四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種實(shí)驗(yàn)場(chǎng)同批孵化、相同環(huán)境飼養(yǎng)的成年四川白鵝母鵝18 只，隨機(jī)分為3組（n=6），自由采食和飲水。對(duì)照組灌喂禽用生理鹽水，試驗(yàn)組根據(jù)鵝體質(zhì)量分別灌喂5 mg/kg和10 mg/kg 精胺，每日于8：00 和20：00 進(jìn)行灌喂。灌喂2周后，于頸部放血處死，迅速采集鵝肝、胸腺、脾和法氏囊組織，稱量，用于后續(xù)試驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)操作都嚴(yán)格按照四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范與福利管理委員會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范》（川農(nóng)大校發(fā)〔2014〕18號(hào)）進(jìn)行。

1.2 免疫器官指數(shù)測(cè)算

鵝肝、胸腺、脾和法氏囊組織的器官指數(shù)計(jì)算公式如下：免疫器官指數(shù)/（g/kg）=免疫器官鮮質(zhì)量/g÷活體質(zhì)量/kg。

1.3 組織總RNA 提取和cDNA 制備

參照Trizol 試劑（TaKaRa 公司，大連）操作說(shuō)明書提取組織樣品總RNA，并取3 μL 總RNA 通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，大連）操作說(shuō)明書制備cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）體系：iTaqTM通用型SYBR Green超預(yù)混液（Bio-Rad Laboratories, CA, USA）5 μL，上游和下游引物各0.2 μL，cDNA 模板0.5 μL，無(wú)RNA酶水4.1 μL，共10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，根據(jù)引物退火溫度（表1）分別退火30 s，72 ℃延伸30 s并采集熒光，共45個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 引物序列信息Table 1 List of primer sequences

1.5 免疫器官組織多胺含量檢測(cè)

參照KANG 等[10]報(bào)道的方法，采用苯甲酰氯柱前衍生并聯(lián)合高效液相色譜檢測(cè)鵝肝、胸腺、脾和法氏囊組織中的多胺含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件的均值過(guò)程進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝免疫器官組織RNA 提取及免疫相關(guān)因子基因擴(kuò)增結(jié)果

如圖1 所示，鵝肝、胸腺、脾和法氏囊組織總RNA的28S和18S片段條帶清晰，未產(chǎn)生降解的5S片段，表明肝、胸腺、脾和法氏囊組織總RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

如圖2 所示，利用已提取的鵝免疫器官組織總RNA（以肝為例），對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 和GAPDH基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明，目的基因片段條帶單一，大小與預(yù)期片段相一致；此外，如圖3所示，TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR熔解曲線呈現(xiàn)單一峰型，表明引物特異性高。因此，本文所設(shè)計(jì)的免疫因子基因引物可用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。

圖1 鵝免疫器官組織總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of total RNA in the immune organ of female geese

圖2 鵝肝組織目的基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of RT-PCR products for target genes in the liver of female geese

圖3 目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR熔解曲線Fig.3 Melt curves of real-time quantitative PCR amplifications of target genes

2.2 精胺對(duì)雌鵝免疫器官指數(shù)的影響

如圖4所示：5 mg/kg精胺灌喂組肝指數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），而10 mg/kg精胺灌喂組鵝肝指數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；不同濃度精胺處理對(duì)雌鵝胸腺、脾和法氏囊指數(shù)均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖4 精胺對(duì)鵝免疫器官指數(shù)的影響Fig.4 Effects of spermine on immune organ indexes of the liver,thymus,spleen and bursa of Fabricius in female geese

2.3 精胺對(duì)鵝免疫器官免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響

由圖5 可知：不同濃度精胺灌喂對(duì)鵝肝組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)較對(duì)照無(wú)顯著影響（P＞0.05），在10 mg/kg 精胺灌喂組的鵝肝組織中IFN-γ 表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，是對(duì)照組的39.37%（P＜0.05）。5 mg/kg 精胺灌喂后，鵝胸腺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），分別是對(duì)照組的40.00%、45.88%、45.30%和11.00%，10 mg/kg 精胺處理對(duì)鵝胸腺TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。5 mg/kg 和10 mg/kg精胺灌喂后，鵝脾組織IFN-γ 基因表達(dá)量分別是對(duì)照組的46.45%和39.04%（P＜0.05），而對(duì)脾組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。5 mg/kg精胺處理組的鵝法氏囊TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)量分別是對(duì)照組的32.84%、49.46%、27.89% 和19.97%（P＜0.05）；10 mg/kg精胺處理組的法氏囊TNF-α和IFN-γ基因表達(dá)量分別是對(duì)照組的78.51%和81.82%（P＜0.05）。

圖5 精胺對(duì)鵝免疫相關(guān)因子基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of spermine on expression levels of genes related to immune factors in female geese

2.4 精胺對(duì)鵝免疫器官多胺代謝的影響

如圖6 所示：外源性精胺處理顯著提高了鵝肝組織精胺含量（P＜0.05），而對(duì)腐胺和亞精胺含量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；10 mg/kg精胺處理顯著增加了法氏囊組織腐胺含量（P＜0.05），顯著降低了精胺含量（P＜0.05），而對(duì)亞精胺水平無(wú)顯著影響（P＞0.05）；不同濃度精胺對(duì)鵝脾和胸腺組織中腐胺、亞精胺和精胺含量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

多胺可作為內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控機(jī)體免疫功能中發(fā)揮著重要作用[11-12]。本實(shí)驗(yàn)室人員前期研究發(fā)現(xiàn)，在正常生理?xiàng)l件下低濃度亞精胺能抑制小鼠TNF-α 和IL-1β 基因的表達(dá)，而高濃度亞精胺則會(huì)促進(jìn)IL-6和IFN-γ基因的表達(dá)，提示免疫相關(guān)因子表達(dá)對(duì)亞精胺存在劑量依賴性[13]。OKUMURA 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，多胺能顯著降低大鼠肝缺血再灌注后血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和IFN-γ的水平，對(duì)趨化因子也有顯著抑制作用。此外，研究表明，在小膠質(zhì)細(xì)胞和急性胰腺炎中，多胺具有抑制TNF-α和IL-6基因表達(dá)的作用[14-15]。

胸腺、法氏囊和脾是禽類主要的免疫器官[16]，而胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾指數(shù)能夠反映機(jī)體免疫水平，在判斷禽類免疫功能中具有重要意義[17]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、致敏及感染組織中精胺含量顯著升高，提示精胺在炎癥和致敏等病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5,18]。本研究結(jié)果表明：不同濃度精胺灌喂對(duì)鵝胸腺指數(shù)、脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)無(wú)顯著影響，在脾和胸腺組織中腐胺、亞精胺和精胺含量均無(wú)顯著變化；10 mg/kg精胺處理顯著下調(diào)鵝肝指數(shù)，同時(shí)，肝組織中精胺水平顯著升高，提示外源性精胺在不同組織中沉積具有組織特異性，肝組織對(duì)外源性精胺處理更加敏感。另外，10 mg/kg精胺處理后，鵝法氏囊組織精胺水平顯著降低，而腐胺水平顯著增加，提示外源性精胺可能加速了法氏囊組織中的多胺分解代謝，促使精胺向腐胺轉(zhuǎn)化。這進(jìn)一步說(shuō)明不同組織中的多胺代謝能力及其對(duì)精胺的耐受量可能存在差異。

圖6 精胺對(duì)鵝免疫器官組織多胺水平的影響Fig.6 Effects of spermine on polyamine contents in the liver,thymus,spleen and bursa of Fabricius of female geese

精胺能通過(guò)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)因子功能參與調(diào)控機(jī)體的免疫功能。ZHANG等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)，精胺能抑制脂多糖誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞TNF-α的釋放，提示精胺具有參與調(diào)控人免疫功能的潛力。HASKó等[1]也發(fā)現(xiàn)，精胺能通過(guò)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL 的分泌來(lái)參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。高水平TNF-α、IL-1β 和IL-6能誘導(dǎo)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，而精胺在轉(zhuǎn)錄水平上能通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)進(jìn)而參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[2,21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，5 mg/kg精胺處理后，鵝胸腺和法氏囊組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)量均顯著降低，與上述研究結(jié)果相似，進(jìn)一步說(shuō)明精胺可介導(dǎo)胸腺和法氏囊組織中TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達(dá)，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控機(jī)體免疫功能。同時(shí)，10 mg/kg 精胺對(duì)胸腺和法氏囊組織中IL-1β 和IL-6 表達(dá)無(wú)顯著影響，提示精胺介導(dǎo)胸腺和法氏囊中IL-1β和IL-6的表達(dá)可能具有劑量依賴性。此外，外源性精胺處理后，鵝肝和脾組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因表達(dá)量相較于對(duì)照組并未發(fā)生顯著變化，提示精胺對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達(dá)的調(diào)控可能具有組織特異性。

IFN-γ是由T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等分泌的Ⅱ型干擾素[23]，可通過(guò)激活效應(yīng)免疫細(xì)胞、促進(jìn)抗原呈遞進(jìn)而發(fā)揮其抗菌、抗病毒和抗腫瘤作用[24-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，精胺對(duì)脾組織中IFN-γ合成釋放有抑制作用，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體免疫能力[1]。在日糧中添加精胺能抑制仔豬胸腺和脾組織中IFN-γ基因表達(dá)[6]。本研究結(jié)果表明，外源性精胺顯著抑制鵝脾中IFN-γ基因表達(dá)，5 mg/kg精胺可抑制胸腺和法氏囊中IFN-γ基因表達(dá)，這與上述結(jié)果相似，說(shuō)明精胺不僅能通過(guò)翻譯水平調(diào)控脾組織中IFN-γ 合成，還能在轉(zhuǎn)錄水平上影響脾組織中IFN-γ基因的表達(dá)[1,6]。

總之，本研究結(jié)果表明，精胺可通過(guò)介導(dǎo)雌鵝免疫相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 基因表達(dá)來(lái)參與調(diào)控鵝免疫功能，并存在劑量依賴性和組織特異性。