短鏈脂肪酸提取與檢測的研究進展*

高 冰，于秋穎，賈海蓮，蘇 軍，邰大鵬，李夢格，戈 娜

(1.包頭醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)與食品健康研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭市環(huán)境監(jiān)測站；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心；4.包頭醫(yī)學(xué)院2012級預(yù)防醫(yī)學(xué)本科班)

眾多研究已表明，腸道菌群失衡與多種肝病的發(fā)生密切相關(guān)，且關(guān)于“腸—肝軸”的研究也越來越受到關(guān)注。SCFA為碳原子數(shù)在6個以下的脂肪酸，主要包括乙酸，丙酸，丁酸等。食物中抗性淀粉、膳食纖維、糖醇和低聚糖等在結(jié)腸內(nèi)被腸道微生物發(fā)酵的產(chǎn)物，是人體內(nèi)短鏈脂肪酸的主要來源。目前，對生物樣品中SCFA的測定被應(yīng)用于反映腸道菌群狀況、結(jié)腸黏膜細胞活性以及某些疾病診斷和治療的輔助手段。

1 短鏈脂肪酸檢測的生物樣品種類

由于糞便及腸內(nèi)容物與腸道特殊的關(guān)系，因此目前常被用于短鏈脂肪酸定性定量研究?，F(xiàn)階段除了對測定糞便及腸內(nèi)容物中SCFA外，還有很多生物樣品被應(yīng)用于該領(lǐng)域的研究，如血液、唾液和呼出氣體等。

1.1唾液 腸腔內(nèi)產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，一部分在腸道中被利用，通過口腔粘膜和細胞膜的滲透進入唾液，另一部分進入血液循環(huán)至肺部，并隨呼吸作用到達口腔，進入唾液。唾液成分包括少量蛋白質(zhì)、電解質(zhì)、激素、DNA、RNA以及其它物質(zhì)等。與其他檢測物相比，唾液分析具有取樣簡單、臨床檢驗快速、適應(yīng)性好等特點，基于血液物質(zhì)和唾液成分的相關(guān)性，可用于多種疾病的臨床診斷。趙曉亞等[1]對41例健康志愿者唾液中7種短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸)定量分析，建立了氣相色譜氫火焰離子化檢測器法測定人體唾液成分。

1.2尿液 尿液中SCFA含量非常低，但它們的羥化物如2-羥異戊酸、β-羥丁酸以及乙酰乙酸、乳酸、富馬酸等短鏈有機酸的含量很高[2]。孫樹英等[3]為更有利于臨床上的診斷和治療，曾以氣相色譜法測定了人尿液中的短鏈脂肪酸，并優(yōu)化了氣相色譜法測定短鏈脂肪酸的實驗條件。王洪存等[4]用氣相色譜法對人尿中短鏈脂肪酸進行了測定實驗，以10 % 改性聚乙二醇-20000-I(FFAP)磷酸為固定液，探索了氣相色譜分離條件，進行了線性關(guān)系、精密度和回收率實驗。同時在正常人尿樣中檢出乙酸和微量丙酸。上述研究均獲得良好的實驗結(jié)果，并對臨床疾病的診斷具有較好的輔助作用。

1.3糞便 糞便是人體的主代謝物，在正常生理條件下糞便中短鏈脂肪酸的種類及其豐度較為穩(wěn)定，同時其變化可靈敏地反應(yīng)炎癥病理條件下腸道微環(huán)境的改變情況，因此，對腸道短鏈脂肪酸檢測可評估腸道微環(huán)境。且糞便作為測定短鏈脂肪酸的生物樣品較其他種類物樣品有采樣簡單、樣品易獲得、方便儲存的優(yōu)點。趙曉亞等[5]建立的頂空氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HS-GC/MS)在人的糞便樣本中檢測到8個短鏈脂肪酸，其中主要為乙酸、丙酸、丁酸。測定大鼠糞便同樣測到了8個SCFA，與人的糞便樣品測定結(jié)果一致，主要仍為乙酸、丙酸、丙酸。劉娟等[6]建立了一種離子排斥色譜方法分離測定了人體糞便中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸5種短鏈脂肪酸。吳水蕓等[7]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定糞便中的短鏈脂肪酸，以大鼠糞便微生物樣品，成功檢測到了短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸。由諸多的研究報道可以看出，因糞便取樣量大，樣品易于獲得和提取，測定效果好等優(yōu)點，其已成為檢測短鏈脂肪酸最為常用的生物樣品。

1.4血漿 血清中含有乳酸、乙酸和丙酮酸，血小板濃縮液中主要含有乳酸、乙酸、丙酮酸和琥珀酸。由于大部分乙酸都在外周組織發(fā)揮作用，在腸道中被吸收的乙酸量極少；大部分丙酸因參與肝異生作用而在肝臟被代謝；而丁酸的主要利用部位為結(jié)腸，所以人血漿中的短鏈脂肪酸以乙酸為主，其他種類如丙酸、丁酸含量則很少。趙曉亞等[5]以HS-GC/MS法測定人和大鼠血漿中短鏈脂肪酸，測得人血漿中短鏈脂肪酸主要以乙酸為主，其他成分較少。同時，測定大鼠血漿中短鏈脂肪酸的結(jié)果與測定人血漿中短鏈脂肪酸結(jié)果基本一致。這一結(jié)果符合人體短鏈脂肪酸的代謝分布情況，也正因如此，在對人體內(nèi)短鏈脂肪酸進行分析研究時，所選的生物樣品多為糞便而非血漿。

2 短鏈脂肪酸的提取方法

短鏈脂肪酸的獨特性質(zhì)決定了其測定時的樣品前處理方法不同于長、中鏈脂肪酸。同時，不同的檢測手段以及不同性質(zhì)的生物樣品也導(dǎo)致它們的前處理方法不盡相同。

2.1蒸餾法 1878年Brieger首次提出直接蒸餾法，經(jīng)過不斷改良為蒸汽蒸餾法、真空蒸餾法等[1]。蒸餾法存在樣品需求量大、強酸酸化樣品導(dǎo)致蛋白和碳水化合物的消化產(chǎn)物污染蒸汽、樣品乙?；纸鈱?dǎo)致乙酸值不準確等缺點，故蒸餾法現(xiàn)已不常使用。

2.2離心超濾法 生物樣品可通過高速離心后再通過半透膜進行分離。劉娟等[6]利用離子排斥色譜法測定人體糞便中五種短鏈脂肪酸，對糞樣進行了以下處理，取樣品分別加NaOH溶液和蒸餾水，渦旋器振蕩，13000 r /min離心5 min，取上清液，用0.2 μm薄膜過濾后，凍存待分析。趙曉亞等[1]在以氣相色譜法對人唾液短鏈脂肪酸進行分析時，對唾液樣品進行了以14000 r / min離心10 min，取上清液，-80℃保存?zhèn)溆玫奶幚怼Ｍ瑫r，在測定之前加入了適量HCl酸化，使短鏈脂肪酸處于游離態(tài)，以便于測定。

2.3萃取法 常用的萃取劑有乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷和氯仿等。先將糞便配成懸液，再加入酸使脂肪酸更易被有機溶劑提取[3]。賈益群等[8]在利用糞便樣品檢測短鏈脂肪酸時，先將純水溶解的樣品離心過濾后加硫酸溶液再加乙醚溶液，再次離心后取上層乙醚溶液待分析備用。液-固萃取法在測定糞水和尿液中的SCFA時也常被使用。這種方法能更好地對一些有機酸進行定量。缺點是較液-液萃取法更加費時費力。固相微萃取(SPME)基于吸附和解析進行樣品處理，是從多種底物中提取半揮發(fā)性和揮發(fā)性物質(zhì)的一種新技術(shù)[2]。其萃取頭為有聚合物薄膜的熔融石英纖維，利用該萃取頭可一步完成提取、濃縮、分離步驟。在分析SCFA時常常需要結(jié)合衍生化技術(shù)來提高SPME的效益及靈敏度。血漿樣品常常需要經(jīng)過去蛋白將樣品純化這一重要步驟后再進行萃取。液-液萃取法是最常用的方法之一，一般使用多種有機溶劑或其混合物作為有機酸的萃取劑，甲醇和氯仿作為典型溶劑可將血清蛋白中的脂肪酸釋放出來。萃取法較其他方法稍顯復(fù)雜，但是樣品的處理效果更好一些，試驗結(jié)果更加準確。

3 短鏈脂肪酸的檢測方法

3.1氣相色譜法(GC) GC是目前國內(nèi)應(yīng)用最為廣泛而常見的檢測脂肪酸的方法，具有分離度好、靈敏度高、檢出限低、重復(fù)性好等特點。分析對象一般為熱穩(wěn)定性、可揮發(fā)性樣品，不可揮發(fā)和熱穩(wěn)定性不好的樣品經(jīng)過衍生化后，揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性增加，其極性降低，可使用GC測定。包娜然等[9]采用氣相色譜法測定了血小板濃縮液和血清中的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸。趙曉亞等[1]用氣相色譜法定量分析了人唾液中的七種短鏈脂肪，并已建立了簡單、快速、準確的氣相色譜-氫火焰離子化檢測器法，奠定檢測唾液中與疾病相關(guān)的揮發(fā)性生物標記物方法學(xué)的基礎(chǔ)。GC衍生化簡單，僅需把羧酸衍生成酯，可以降低這些揮發(fā)性酸的蒸發(fā)損失，用有機溶劑直接提取后進樣分析。賈益群等[8]建立了GC檢測糞便中短鏈脂肪酸的定性、定量方法，分離效果好，回收率高，無需衍生化，使用乙醚-硫酸 (50 %) 在15 min內(nèi)可以分離出生物樣品中的6種短鏈脂肪酸，并可以整體診斷體內(nèi)厭氧菌的變化。采用衍生化和非衍生化兩種方法測定人血清中的脂肪酸含量，采用正己烷-異丙醇 (4∶1) 提取血清中的游離脂肪酸后直接經(jīng)GC進樣，結(jié)果顯示非衍生化方法具有操作步驟少，中、短鏈游離脂肪酸回收率高的優(yōu)點[8]。

3.2高效液相色譜法(HPLC) HPLC對大分子、高沸點、熱穩(wěn)定性差、極性強的化合物分離具有優(yōu)勢，準確度高，分析過程條件相對溫和。紫外(UV)檢測法測定唾液、血漿、糞便和尿液中的SCFA，真空蒸餾生物樣品，在堿性條件下凍干濃縮，通過磺酸基聚苯乙烯-二乙烯基苯色譜柱上分離，測定結(jié)果與氣相色譜所得結(jié)果具有一致性[9]。HPLC可選用的儀器較多，如電化學(xué)、化學(xué)、紫外和熒光發(fā)光檢測器。電化學(xué)檢測器靈敏度和特異性高，可以不用衍生化直接檢測脂肪酸，而熒光和紫外檢測器的重現(xiàn)性好?，F(xiàn)通常先將SCFA衍生化后再采用熒光或紫外檢測器進行檢測。

3.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS) GC-MS靈敏度高、分離度好、分辨率高、重復(fù)性佳、檢出限低，其優(yōu)勢在于微量或痕量分析，可對未知化合物進行快速檢索和鑒定。吳水蕓等[7]建立了快速檢測糞便樣品中的短鏈脂肪酸的GC-MS法，對其應(yīng)用于腸道疾病輔助診斷進行了探究。最終結(jié)果是在所有標本中均檢出多種短鏈脂肪酸，其種類主要有乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。在生理條件下，人與鼠短鏈脂肪酸的種類和相對豐度比都十分相似，同時發(fā)現(xiàn)腸炎可使糞便中除乙酸外的其他短鏈脂肪酸的相對豐度下降，其中，尤以丁酸下降最為明顯[10]。結(jié)果表明GC-MS法有可能應(yīng)用于腸炎等腸道疾病的輔助診斷。

3.4離子色譜法(ICE) ICE方法也較成熟，使用較多，主要用于分析細菌終末代謝酸。劉娟等[6]建立了一種離子排斥色譜分離測定人糞便樣品中五種短鏈脂肪酸的方法。以體積分數(shù)0.1 % 磷酸為流動相、提取的樣品在50 ℃下用Shodex Rspak KC-811離子排斥柱分離，紫外檢測器在210 nm處測定其中的有機酸，測得結(jié)果令人滿意，同時優(yōu)化了色譜分離條件。

3.5毛細管電泳法(CE) CE測定SCFA的優(yōu)點是

簡便快速、反應(yīng)條件溫和、樣品量少等，有等速電泳、膠束電動毛細管色譜、毛細管區(qū)帶電泳等方法。CE用磷酸緩沖液(pH 6.0)，甲醇作為改良劑可直接分離并在波長200 nm下檢測尿中包括 SCFA在內(nèi)的多種有機酸，可對SCFA進行快速有效的分離[11]。

4 展望

通過生物樣本中短鏈脂肪酸的測定，可以研究腸道菌群的種類及含量的變化與某些疾病之間的關(guān)系，從而對疾病的診斷和治療有一定的輔助作用。同時針對檢測短鏈脂肪酸的生物樣品，目前利用較多的為糞便樣品，關(guān)于其他生物樣品如血漿、呼出氣體、腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸的檢測研究還十分匱乏，今后應(yīng)在除糞便以外的生物樣品中加大研究力度。同樣應(yīng)在研究的同時探索更加簡便、快捷、樣品需求量小、分離效果好、省時省力的樣品處理方法。最重要的是，關(guān)于短鏈脂肪酸的檢測，現(xiàn)大多數(shù)研究均著眼于氣相色譜法檢測短鏈脂肪酸，利用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，可使得脂肪酸的定量、定性得到更深入的研究，為相關(guān)的疾病的臨床診治提供可靠依據(jù)。所以，應(yīng)在日后的研究中不斷優(yōu)化液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等方法的實驗條件，以求得更加高效、準確、精密度靈敏度更高的檢測方式。