納米氧化石墨烯誘導(dǎo)人類支氣管上皮細胞DNA氧化與甲基化的實驗研究

彭長鳳，謝 杏，柯躍斌*

(深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518020)

納米氧化石墨烯(nano-graphene oxide，NGO)是一類應(yīng)用廣泛的新興非金屬納米材料，是一種由碳原子組成的六角形蜂巢晶格的二維結(jié)構(gòu)材料。石墨烯具有獨特的電學(xué)機械性能、良好的導(dǎo)熱導(dǎo)電性、超大的比表面積以及潛在的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于材料、電子、能源、光學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，如電化學(xué)設(shè)備、能源存儲、細胞成像、藥物輸送和生物傳感器等[1-2]。隨著石墨烯大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，其生物安全性問題也越來越受到關(guān)注。近期研究發(fā)現(xiàn)，NGO可能具有表觀遺傳毒性[3-4]。

呼吸系統(tǒng)是石墨烯的直接作用系統(tǒng)，石墨烯誘發(fā)肺損傷是石墨烯毒性的主要癥狀[5-6]。人體吸入的絕大多數(shù)石墨烯納米顆粒會穿過上呼吸道進入到肺部，在肺部沉積，呼吸道檢測到的石墨烯納米顆粒沉積率約為4%[1-3，7-8]。石墨烯的粒徑大小與氧化程度直接影響其細胞毒性，且存在明顯的濃度依賴性，但現(xiàn)有針對NGO致支氣管上皮細胞損傷的實驗研究較少，且作用機制尚不清楚[9-10]。因此，本研究觀察特定粒徑和劑量的NGO在人類支氣管上皮細胞(16HBE)中產(chǎn)生的DNA氧化與甲基化作用，從而評估NGO所致的表觀遺傳修飾作用，為納米氧化石墨烯遺傳毒性效應(yīng)研究、機制探討以及安全性評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

薄層NGO購于美國Cheap Tubes公司；ROS檢測試劑盒購于上海酶聯(lián)生物；DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清購于美國Gibco公司；人支氣管上皮16HBE細胞購于美國ATCC公司；脫氧胞苷、5-甲基脫氧胞苷標準品均由Sigma公司提供。其他試劑包括：胰蛋白酶凍干粉(美國Sigma公司)；基因組DNA純化試劑盒(美國Tiangen公司)；DNA甲基化定量試劑盒(美國Epigentek公司)；DNA羥甲基化定量試劑盒(美國Zymo Research公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液(TE緩沖液，美國Sigma公司)；WB試劑盒(日本W(wǎng)ako公司)；10%小牛血清(美國Hyclone公司)；核酸酶P1(日本Yamasa公司)；離子交換樹脂(日本Muromachi Kagaku公司)。實驗中使用的主要儀器有：Ultrafree-Probind濾器(美國Millipore公司)；電泳儀(美國BIO-RAD公司)；高效液相色譜柱(美國Beckman Ultrasphere-ODS公司)；電化學(xué)檢測器(Coulochem II，美國ESA Inc公司)；透射電子顯微鏡(TEM，日立H-7650)。

1.2 石墨烯納米材料的表征

1.2.1 NGO表征NGO粉劑，加入蒸餾水超聲稀釋為1 000 mg/L的儲備液備用。納米材料的表征通過TEM和拉曼光譜鑒定，觀察NGO的表面形貌結(jié)構(gòu)及粒徑分布。

1.2.2 粒徑分布及純度使用NICOMP 380ZLS Submicron Particle Sizer測定NGO溶液的有效粒徑分布和Zeta電位(30 mg/L，pH=7.4)。并使用激光粒度分布儀檢測NGO與MEM培養(yǎng)基混合24 h后的中位粒徑(D50)，以檢測用于染毒細胞時的有效粒徑。

使用ICP-MS Thermo Elemental X7檢測NGO化學(xué)純度，包括重金屬元素等。檢測結(jié)果顯示，樣品純度達到99.99%以上，該納米NGO符合實驗要求。

1.3 細胞培養(yǎng)及NGO染毒實驗分組

1.3.1 細胞培養(yǎng)16HBE細胞，復(fù)蘇后按每孔1.25×106個培養(yǎng)于6孔板中。采用DMEM培養(yǎng)液，含10%小牛血清，100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，但不含有酚紅，以避免實驗中因酚紅而產(chǎn)生的氧化效應(yīng)的干擾。置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 NGO染毒實驗分組每組設(shè)3個平行樣孔，根據(jù)既往的細胞毒性試驗確定細胞暴露濃度。陽性對照組以3 μmol/L DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，DAC)預(yù)處理24 h，并標記為DAC組；以溶劑平行處理16HBE細胞24 h為陰性對照組。同步培養(yǎng)16HBE細胞至約鋪滿50%孔底面積時，分別用1.25、2.5、5和10 μg/mL的NGO染毒24 h。染毒完成后檢測細胞DNA中8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)和 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)的比例，分析NGO致細胞DNA氧化、甲基化的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

1.4 高效液相色譜法檢測細胞DNA中8-OHdG比例

16HBE細胞DNA的8-OHdG水平檢測方法參考文獻[11]。應(yīng)用WB試劑盒提取細胞DNA，再用核酸酶P1消化DNA，獲得核苷形式的8-OHdG，并以Muramac離子交換樹脂處理。采用Ultrafree-Probind濾器過濾核苷溶液，并注射入高效液相色譜柱(5 μm，4.6 mm×25 cm)中，用電化學(xué)檢測器進行操作，流速為1.0 mL/min。流動相包含10 mmol/L Na2HPO4，8%甲醇。DNA中8-OHdG比例用8-OHdG/105dG表示[11]。

1.5 高效毛細管電泳法檢測DNA整體甲基化水平

1.5.1 樣品處理樣品處理和高效毛細管電泳按參考文獻[12]并略作修改，樣品處理步驟如下：取10 μg DNA，37℃條件下RNAase A消化1 h；用3 mol/L NaAc(pH=5.2)和無水乙醇沉淀DNA。DNA溶于10 μL ddH2O中，沸水中水浴5 min，冰上冷卻。在30 mmol/L 的 NaAc中加入 1.5 μL ZnSO4(10 mmol/L)和1.5 μL核酸酶P1(200 U/mL)，37 ℃下孵育18 h。在2.5 mol/L 的(NH4)2SO4中加入 1.25 μL Tris(0.5 mol/L，pH=8.3)和0.75 μL堿性磷酸酶(50 U/mL)，37 ℃下孵育2 h。10 000 r/min離心5 min，4℃保存待分析。

1.5.2 高效毛細管電泳毛細管電泳儀正極進樣，汞燈，紫外檢測波長為254 nm；采用70 cm×75 μm的毛細管，有效分離長度為65 cm；電泳緩沖液由48 mmol/L NaHCO3(pH=9.6)及60 mmol/L SDS組成，電泳條件25℃、15 kV，紫外檢測波長254 nm；電泳系統(tǒng)先用1.0及0.1 mol/L NaOH平衡3 min，電泳緩沖液用48 mmol/L的NaHCO3(pH=9.6)和60 mmol/L的SDS平衡3 min；采用10 cm高度重力進樣30 s。在dA、dT和dG(均為0.50 mmol/L)的混合標準品中逐漸增加dC的量和減少5-mdC的量，以得到5-mdC系列百分比。選擇已知dC和5-mdC本底濃度的實際DNA樣品各9份，在樣品中分別加入0.010、0.015和0.020 mmol/L的3種不同濃度的標準品dC和5-mdC后，再次測定樣品中dC和5-mdC的濃度，每種濃度水平重復(fù)測3次，計算加標回收率。如圖1所示，出峰圖基線穩(wěn)定，兩個目的峰dC和5-mdC分離效果很好。由于樣品中5-mdC/(5-mdC+dC)的比值非常低，且5-mdC的含量在0.01 mmol/L左右，如果直接測定dC與5-mdC會產(chǎn)生較大誤差；本實驗中，以5-mdC/(5-mdC+dC)的濃度比值為橫坐標，以A5-mdC/(A5-mdC+AdC)峰面積的比值為縱坐標進行定量分析[12]，可以直接準確得到樣品中DNA整體甲基化的水平結(jié)果。

圖1 高效毛細管電泳法檢測基因組DNA甲基化水平

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。計量資料組間均數(shù)的比較用單因素方差分析，進一步的兩兩比較采用Dunnett's t檢驗，檢驗水準為α=0.05。DNA氧化與DNA甲基化作用的關(guān)聯(lián)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 NGO納米顆粒的表征

使用TEM對不同粒徑(500 nm和3 μm)的NGO進行直接表征觀察和拉曼光譜鑒定。結(jié)果顯示，本實驗材料表征顯示NGO符合實驗要求，如圖2所示。

圖2 NGO顆粒的透射電鏡分析圖

為了確定暴露過程中的真實粒徑，將NGO用含血清的MEM培養(yǎng)基稀釋到最大的工作濃度，37℃放置24 h，測其有效中位粒徑D50為(6.65±0.40)μm。接近廠商標注值。

2.2 NGO染毒對16HBE細胞DNA中8-OHdG比例的影響

預(yù)實驗研究表明，NGO對16HBE細胞的IC50值為25 μg/mL。16HBE細胞經(jīng)不同濃度NGO染毒24 h后DNA中8-OHdG的比例如圖3所示，在NGO為2.5～10 μg/mL時，試驗組細胞DNA中8-OHdG比例顯著高于對照組(P＜0.05 或 P＜0.01)，以 10 μg/mL 濃度時為最高。

圖3 不同組別16HBE細胞DNA中8-OHdG的比例

2.3 NGO染毒對16HBE細胞DNA總體甲基化水平的影響

經(jīng)NGO染毒處理24 h后，用HPCE電泳檢測16HBE細胞DNA的總體甲基化水平。實驗結(jié)果如圖4，顯示NGO可引起16HBE細胞DNA甲基化程度降低，與對照組細胞相比，2.5、5和10 μg/mL NGO組分別降低37.1%、49.7%和46.3%，與對照組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。陽性對照組5-aza-dC處理后使16HBE細胞甲基化程度減少53.8%(P＜0.01)。

圖4 NGO對16HBE細胞DNA總體甲基化水平的影響

2.4 NGO染毒對DNA氧化與DNA甲基化影響的關(guān)聯(lián)性分析

NGO在1.25～10 μg/mL范圍染毒后，試驗組細胞DNA中8-OHdG比例與細胞基因組總體DNA甲基化水平的潛在關(guān)聯(lián)性，用Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示此劑量范圍內(nèi)NGO處理后，DNA氧化與DNA甲基化作用間呈負相關(guān)(r=-0.69，P＜0.01)。

3 討論

DNA氧化是指機體細胞在內(nèi)源性和外源性活性氧自由基的作用下，其DNA被氧化生成8-OHdG，它在復(fù)制過程中可以與C以外的其它堿基配對形成點突變，8-OHdG已普遍被作為DNA氧化損傷的敏感標志物[11-14]。衰老、癌癥、心腦血管疾病等的發(fā)生與該損傷有關(guān)[11，15]。NGO與細胞相互作用產(chǎn)生過量的ROS是產(chǎn)生急性肺損傷、炎性反應(yīng)、細胞凋亡、DNA損傷等的主要原因[1]。本次研究發(fā)現(xiàn)NGO染毒使16HBE細胞DNA中8-OHdG比例增加，可能是ROS氧化鏈式反應(yīng)的結(jié)果。據(jù)報道，SOD和GSH的活性隨著NGO暴露時間和暴露劑量的增加而降低[16]。石墨烯處理細胞后，由ROS介導(dǎo)的MAPK(JNK、ERK、p38)以及TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以及與凋亡相關(guān)信號(bcl-2、caspase-3)及下游基因PARP等被激活[17]。

表觀遺傳分子機制包括DNA甲基化、RNA干擾、基因沉默、組蛋白修飾等，DNA甲基化是目前研究最多的表觀遺傳修飾方式。DNA甲基化是哺乳動物細胞最為常見的表觀遺傳修飾方式，其引起的基因轉(zhuǎn)錄沉默與哺乳動物生長發(fā)育、避免遺傳損傷、基因印記、X染色體靜息，以及衰老、癌癥的過程之間有密不可分的關(guān)系[15，18-19]。

最新研究表明，NGO暴露通過上調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B基因改變?nèi)蚪M甲基化水平[20]。單層石墨烯和少數(shù)層石墨烯引起的全基因組甲基化具有劑量依賴性，不同石墨烯衍生物引起的甲基化水平為：羧化石墨烯＞胺化石墨烯＞石墨烯[4]。本次研究發(fā)現(xiàn)納米NGO引起16HBE細胞甲基化程度降低，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

本研究首次報道了DNA氧化和DNA甲基化作用的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)DNA氧化與DNA甲基化作用間呈負相關(guān)關(guān)系，反映出生命現(xiàn)象的復(fù)雜性，提示DNA氧化可能是與DNA甲基化密切相關(guān)的兩個重要的早期分子事件。

然而，造成基因組DNA甲基化水平隨NGO劑量增大而降低的機制仍不清楚。有研究表明在CpG二核苷酸序列中出現(xiàn)的8-OHdG對相鄰近的胞嘧啶殘基的甲基化有很強的抑制作用，并且還能夠干擾限制性內(nèi)切酶對DNA酶切作用[21]。還有研究提示氧化損傷可造成DNA甲基化模式異常，8-OHdG加和物取代正常鳥嘌呤后，可以與甲基化酶結(jié)合而競爭性抑制鄰近胞嘧啶的甲基化，特別是在新合成的DNA子鏈中甲基化水平被極度抑制。如果甲醛介導(dǎo)氧化損傷所形成的8-OHdG未被DNA修復(fù)系統(tǒng)糾正，就可能破壞固有的甲基化模式，以被動去甲基化的形式，通過DNA的半保留復(fù)制造成甲基化的丟失[22-23]。

目前有關(guān)石墨烯哺乳動物毒性的研究已在逐步深入，但目前尚缺乏石墨烯與DNA、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子相互作用方式和機制的研究。鑒于目前已經(jīng)開展了石墨烯對人和小鼠等哺乳動物的毒性研究，今后石墨烯對植物等其他生物的毒性作用也應(yīng)成為生物安全性評估的內(nèi)容。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)DNA氧化與DNA甲基化作用間呈負相關(guān)關(guān)系，提示DNA氧化可能是與DNA甲基化密切相關(guān)的兩個重要的早期分子事件。DNA氧化可能導(dǎo)致細胞DNA甲基化水平降低，在化學(xué)致突變過程中，DNA氧化可能是影響細胞甲基化的調(diào)控路徑之一，而DNA甲基化如何反過來影響DNA氧化、二者的時間-劑量-效應(yīng)關(guān)系尚需進一步研究。