肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體對BSA致大鼠肝纖維化的保護(hù)作用研究

張石蕾，由淑萍，趙 軍，劉 濤，*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院基礎(chǔ)護(hù)理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆維吾爾族自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

近年來，化學(xué)及藥理學(xué)研究顯示，肉蓯蓉苯乙醇總苷(Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[1]。CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，CPhGs對牛血清白蛋白誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠有一定的預(yù)防和治療作用[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，CPhGs存在吸收差、口服利用度低等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到影響[3]。脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)具有生物相容性良好，改善藥物的穩(wěn)定性、溶解性，增強(qiáng)藥物療效，降低給藥頻率的作用，近年來在基礎(chǔ)及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注[4]。因此本文以脂質(zhì)體為藥物載體包裹中藥成分CPhGs制成CPhGs脂質(zhì)體，然后應(yīng)用于肝纖維化模型動(dòng)物考察CPhGs脂質(zhì)體對肝纖維化大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、 層 粘連蛋 白 (Laminin， LN)，透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase，HA)，III型前膠原(Procollagen III，PC III)和 IV 型膠原(Collagen-IV，IV-C)含量的影響，肝臟組織膠原纖維分布情況的變化，膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和膠原蛋白III(Collagen III)mRNA表達(dá)含量的差異，以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle actin，α-sma)和Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)水平的差異，闡明其對肝臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛血清白蛋白購于美國Sigma-Aldrich公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)測試盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠Hyaluronidase-1(HYAL1)ELISA Kit，大鼠laminin(LN)ELISA Kit購于武漢華美生物工程有限公司；大鼠PCⅢ(ProcollagenⅢ)ELISA Kit，Rat COL4(Collagen TypeⅣ)ELISA Kit購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Precision Plus ProteinTMDual Color Standards購于美國BIO-RAD公司；兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗α-SMA多克隆抗體、兔抗CollagenⅠ多克隆抗體購于北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 儀器

CK-40型熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；全波長自動(dòng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢驗(yàn)測試儀購于美國Thermo Scientific公司；FluorChem E化學(xué)發(fā)光高靈敏凝膠成像儀購于美國Protein Simple公司；Zeta sizer Nano series ZS90粒徑分析儀購于英國Malvern公司。

1.3 CPhGs脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備CPhGs脂質(zhì)體。稱取卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇(質(zhì)量比為1∶2∶2)，溶于適量氯仿和甲醇混合溶劑中(體積比為2∶1)，在49～50℃下旋轉(zhuǎn)使其成為膜狀，加入250 μg/mL的CPhGs不斷旋轉(zhuǎn)水化，使磷脂膜轉(zhuǎn)入水中形成脂質(zhì)體，所得脂質(zhì)體用0.45 μm的微孔濾膜擠壓4～5次，0.22 μm的微孔濾膜擠壓18～20次，真空冷凍干燥24 h，即得粒徑均勻的苯乙醇總苷脂質(zhì)體。使用激光粒度分析儀檢測其粒徑分布，在透射電鏡下觀察粒子外形，HPLC法測定其載藥量及包封率。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、模型制備和給藥

SPF級(jí)雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(新)2018-0002。SPF環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(新)2018-0003，飼養(yǎng)受控環(huán)境條件為室溫25℃、光/暗周期12 h，大鼠自由進(jìn)食與飲水，喂飼標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后使用。

65只SD大鼠隨機(jī)分為2組，即正常對照組13只，BSA致敏模型組52只。模型組大鼠采用課題組前期[2]建立的方法制備大鼠免疫性肝纖維化模型，造模分為致敏階段和尾靜脈攻擊階段。致敏階段：大鼠均多點(diǎn)皮下注射sc含BSA 9 g/L弗氏不完全佐劑，每次0.5 mL，共5次。前2次注射間隔為14 d，后3次注射間隔為7 d。末次致敏注射后1周，每只大鼠于眼內(nèi)眥靜脈叢采血，采用雙向瓊脂擴(kuò)散法檢測大鼠血清抗BSA抗體。攻擊階段：剔除模型組中4只未檢測到BSA抗體的大鼠，余48只大鼠隨機(jī)分為4組即模型組、空白脂質(zhì)體組、肉蓯蓉苯乙醇總苷原料藥組、肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體組，每組12只，繼續(xù)尾靜脈注射BSA，每周2次，連續(xù)5周，注射劑量由每只2 mL逐漸遞增至每只4 mL。正常對照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水尾靜脈攻擊造模同時(shí)按設(shè)定劑量灌胃給藥每日1次，肉蓯蓉苯乙醇總苷原料藥組、肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體組給予相當(dāng)于肉蓯蓉苯乙醇總苷原料藥物量125 mg/kg灌胃受試物(劑量參照文獻(xiàn))[2]，正常對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，空白脂質(zhì)體組按肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體組脂質(zhì)體的量給藥。造模結(jié)束后繼續(xù)給予受試物4周，每日1次，總實(shí)驗(yàn)周期共計(jì)15周。末次給藥后，禁食不禁水，24 h后按3～4 mL/kg用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，4℃放置2 h后以3 000 r/min離心10 min，留取血清待檢；處死所有大鼠，迅速剖取肝臟相同部位組織，以生理鹽水漂洗后，一部分用作組織病理學(xué)Masson染色，另一部分存于凍存管投于液氮并在-80℃條件下保存用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測

取大鼠血清樣品采用微板法檢測各組大鼠血清中ALT、AST濃度，ELISA法檢測中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C濃度的變化。

1.6 Masson染色

切取肝臟中間部分肝組織(約1 cm3)用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4～5 μm薄片，Masson染色，在光學(xué)顯微下觀察肝臟組織膠原纖維分布情況。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠肝組織CollagenⅠ和CollagenⅢ mRNA表達(dá)的影響

分別取每只大鼠肝組織30 mg，經(jīng)勻漿后用Trizol提取各組肝組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR CollagenⅠ和CollagenⅢ mRNA檢測，程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃、30 s；變性95℃、3 s，退火60℃、30s，總共40個(gè)循環(huán)。引物由華大基因設(shè)計(jì)合成。CollagenⅠ：上游5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAA GAATG-3′，下游 5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCA C-3′。Collagen Ⅲ：上游 5′-GACACGCTGGTGCTCA AGGAC-3′，下游5′-GTTCGCCTGAAGGACCTCGTTG-3′。目的基因CT值經(jīng)同一樣本的內(nèi)參基因校正后計(jì)算各組間每個(gè)基因的ΔCT，通過 2-ΔΔCT計(jì)算組間對應(yīng)基因的表達(dá)差異。

1.8 Western blot檢測大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平

分別取每只大鼠肝組織30 mg，經(jīng)勻漿后用RIPA裂解液及離心處理，提取各組肝組織中的總蛋白，上樣于聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行還原性SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)(PVDF膜)，200 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min。封閉液(5%脫脂奶粉)封閉PVDF膜過夜，用1×TBST緩沖液充分振蕩清洗，TBST稀釋抗體，一抗稀釋度為：α-sma，1∶ 5 000； Collagen Ⅰ ， 1∶ 5 000； β-actin， 1∶5 000。ECL顯色。FluorChem E化學(xué)發(fā)光高靈敏凝膠成像儀上檢測條帶灰度值。

蛋白相對表達(dá)水平=目的條帶灰度/β-actin條帶灰度×100%

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果以xˉ±s表示，計(jì)量資料采用方差分析，組間比較采用LSD法，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體的物理性質(zhì)

采用前述方法制得的肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體的粒徑為(207.7±2.31)nm，Zeta電位為(-61.5±3.18)mV，圖1～3分別為肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體的透射電鏡圖像、粒度分布、Zeta電位分析圖譜，可見表面有厚度均勻的包衣包裹，且粒度分布均勻。肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體載藥量為(3.77±0.07)%，包封率為(37.2±0.30)%。

圖1 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體透射電鏡圖像

圖2 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體激光粒度儀粒度分布分析圖譜

圖3 肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體Zeta電位分析圖譜

2.2 大鼠肝功能生化指標(biāo)變化

大鼠血清肝功能生化指標(biāo)ALT、AST濃度的變化見表1，與正常對照組相比較，模型組大鼠血清ALT、AST濃度顯著增加(P＜0.05)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比較，肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組、肉蓯蓉總苷原料藥組均能顯著降低模型大鼠血清ALT、AST濃度(P＜0.01)，空白脂質(zhì)體組ALT、AST濃度下降不明顯(P＞0.05)；與肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組比較，空白脂質(zhì)體組、肉蓯蓉總苷原料藥組ALT、AST濃度顯著升高(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Z各組大鼠血清肝功能生化指標(biāo)ALT、AST濃度的變化(x±s)

2.3 大鼠血清LN、HA、PC III和IV-C濃度比較

大鼠血清LN、HA、PC III和IV-C濃度的比較見表2，與正常對照組相比較，模型組大鼠血清中LN、IV-C、HA、PC III濃度顯著增加(P＜0.05)。與模型組相比較，肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組、肉蓯蓉總苷原料藥組均能顯著降低模型大鼠血清中LN、HA、PC III濃度(P＜0.01)，空白脂質(zhì)體組LN、HA、PC III濃度無明顯變化(P＞0.05)；與肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組相比較，肉蓯蓉總苷原料藥組血清中PC III濃度變化不明顯(P＞0.05)，HA濃度顯著增加(P＜0.01)，LN水平有所上升(P＜0.05)；與模型組相比較，肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組能顯著降低大鼠血清中IV-C濃度(P＜0.01)，肉蓯蓉總苷原料藥組能降低大鼠血清中IV-C濃度(P＜0.05)；肉蓯蓉總苷原料藥組大鼠血清中IV-C濃度高于肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組(P＜0.01)。

表2 各組大鼠血清LN、HA、PC III、IV-C濃度的變化

2.4 大鼠肝組織Masson染色結(jié)果

Masson膠原染色結(jié)果見圖4，顯示正常對照組的大鼠肝組織并無明顯的異常，未見炎細(xì)胞浸潤，肝小葉構(gòu)造清晰而完整，肝細(xì)胞呈條索狀分布，未見有不規(guī)則血竇，匯管區(qū)無擴(kuò)大，肝臟匯管區(qū)有極少量膠原纖維存在，肝小葉間未見纖維組織。與正常對照組相比較，模型組大鼠肝組織中纖維明顯增多，分布廣泛，可相互連接形成較粗大的纖維間隔，多位于匯管區(qū)和血管周圍。肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組、肉蓯蓉總苷原料藥組大鼠肝組織中膠原纖維明顯減少，其中肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組組肝組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)良好，趨向正常，效果優(yōu)于肉蓯蓉總苷原料藥組。

圖4 各組大鼠肝組織Masson染色圖(100×)

2.5 大鼠肝組織CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表達(dá)情況

qPCR檢測結(jié)果見圖5，顯示模型組大鼠肝組織ECM調(diào)節(jié)因子(CollagenⅠ、CollagenⅢ)mRNA的表達(dá)水平較正常對照組大鼠肝組織明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組、肉蓯蓉總苷原料藥組與模型組相比，CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，空白脂質(zhì)體組較模型組無顯著性差異；與肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組相比，肉蓯蓉總苷原料藥組肝組織CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)。

圖5 各組大鼠肝組織CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表達(dá)水平

2.6 各組大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白表達(dá)情況

Western blot檢測結(jié)果見圖6，顯示與正常對照組相比，模型組大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白的表達(dá)水平明顯增加(P＜0.05)。與模型組相比較，肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組、肉蓯蓉總苷原料藥組顯著降低了肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白的表達(dá)，空白脂質(zhì)體組α-sma和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平較模型組相比無顯著性差異；與肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組相比，肉蓯蓉總苷原料藥組肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白的表達(dá)水平明顯增加(P＜0.05)。

圖6 各組大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白表達(dá)情況

3 討論

肝纖維化是肝臟對各種慢性刺激進(jìn)行損傷修復(fù)時(shí)發(fā)生的病理變化，其特征為細(xì)胞外基(extracellular matrix，ECM)合成增多而降解相對減少，導(dǎo)致其在肝內(nèi)過多沉積[5]。目前抗肝纖維化的主要策略包括：治療原發(fā)病，抑制ECM增生，促進(jìn)ECM降解，抑制HSCs活化與誘導(dǎo)其凋亡[6]。

現(xiàn)代藥理研究表明，肉蓯蓉有潤腸通便、保肝、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗衰老、抗疲勞等作用[7]。其中起主要作用的一類成分便是苯乙醇苷類物質(zhì)。但是有研究發(fā)現(xiàn)，苯乙醇總苷滲透性差，腸道吸收不良、體內(nèi)生物利用度低，口服劑量(100 mg/kg)后大鼠血清中松果菊苷水平極低，絕對生物利用度僅為0.83%[8-9]。脂質(zhì)體靶向遞藥系統(tǒng)能在病變局部形成相對較高的藥物濃度，而脂質(zhì)體就是其中一種重要的納米微粒，可提高藥物穩(wěn)定性，增加藥物的溶解度[10]。Zhu[11]等人研究發(fā)現(xiàn)，與高良姜素原料藥相比，高良姜素脂質(zhì)體能夠更好地在CCl4致小鼠肝毒性方面起到保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)Masson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠纖維組織明顯增生并向肝小葉內(nèi)伸展，分布廣泛，可相互連接形成較粗大的纖維間隔，肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)良好，趨向正常，且效果優(yōu)于肉蓯蓉總苷原料藥組。實(shí)驗(yàn)中損傷模型大鼠的血清AST、ALT均明顯升高，肉蓯蓉總苷原料藥組、肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體藥物組對大鼠肝功能均有所改善，尤其以肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體藥物組的改善情況最為理想，較接近于正常組水平。肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組能夠更有效的降低肝纖維化指標(biāo)(LN、HA、PCⅢ、IV-C)，較其他組更接近于正常水平，但肉蓯蓉總苷原料藥組稍差。提示肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組能夠改善肝纖維化大鼠的一般情況及肝功能，緩解肝臟纖維化程度，其作用強(qiáng)于相同劑量的肉蓯蓉總苷原料藥組，Masson染色結(jié)果也顯示，肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組膠原沉積較原料藥組有所減輕，說明肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組對抗肝細(xì)胞損傷作用比純藥有著明顯優(yōu)勢，對肝臟保護(hù)，特別是對肝細(xì)胞保護(hù)有著確切的作用。

在肝纖維化初期，ECM主要成分由正常Ⅰ、Ⅳ型膠原為主轉(zhuǎn)變?yōu)棰?、Ⅲ型膠原所占比例增大[12]。當(dāng)HSC被激活后，α-SMA表達(dá)大量增加，并附著于假小葉增生的纖維膈內(nèi)，與HSC的活化、增殖、復(fù)制呈正相關(guān)，是HSC活化的特有標(biāo)志物[13]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組相比，肉蓯蓉總苷原料藥組大鼠肝組織α-sma和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示可能是由于脂質(zhì)體通過與靶細(xì)胞內(nèi)吞、融合、釋放和吸附過程，增加肉蓯蓉總苷原料藥體內(nèi)穩(wěn)定性，從而達(dá)到提高保肝作用。

綜上可見，肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組具有更強(qiáng)的抗肝纖維化作用。能夠使肝靶向性顯著增強(qiáng)，從而達(dá)到更好的保護(hù)肝臟細(xì)胞的作用。無論從肝功能數(shù)據(jù)還是病理結(jié)果分析均顯示肉蓯蓉總苷脂質(zhì)體組均優(yōu)于肉蓯蓉總苷原料藥組對肝纖維化大鼠肝臟的保護(hù)。