性別和年齡對(duì)60Co γ射線照射離體人外周血輻射敏感基因mRNA表達(dá)的影響

李 爽，陸 雪，封江彬，田 梅，蔡恬靜，劉青杰*

(中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088)

隨著核能的開發(fā)與電離輻射的廣泛應(yīng)用，核事故和輻射事故時(shí)有發(fā)生，在這種情況下，很有可能發(fā)生大規(guī)模人群受照的突發(fā)事故，快速、準(zhǔn)確的確定具體的受照射劑量將對(duì)急性輻射損傷傷員的分類、診斷和治療具有至關(guān)重要的作用[1-3]。由于突發(fā)放射性事故中通過直接或間接物理劑量監(jiān)測(cè)裝置無法及時(shí)、有效地提供受照情況記錄，直接影響輻射損傷人員的醫(yī)學(xué)分類和救治。因此，需要建立快速、高通量的生物劑量估算方法。廣泛用于輻射生物劑量估算的染色體畸變分析因試驗(yàn)周期長、技術(shù)要求高等缺點(diǎn)，無法滿足快速、高通量的要求。近年來，將輻射誘導(dǎo)基因的表達(dá)改變作為潛在的生物劑量計(jì)，因其可通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速和高通量檢測(cè)成為研究的熱點(diǎn)。

目前，在現(xiàn)有對(duì)輻射應(yīng)答基因研究中，因研究對(duì)象、分析時(shí)間和所用芯片來源不同，所涉及輻射誘導(dǎo)差異表達(dá)的基因也有所不同[4-5]。雖然國內(nèi)外很多研究已經(jīng)確定了輻射強(qiáng)度與一些基因mRNA表達(dá)水平的劑量-效應(yīng)關(guān)系，但由于這種現(xiàn)象并不是在所有細(xì)胞類型、劑量范圍和照射后的不同時(shí)間點(diǎn)都出現(xiàn)，因此，應(yīng)用單基因的劑量-效應(yīng)曲線估算受照劑量的準(zhǔn)確度較差[6]。本研究在前期應(yīng)用文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)和系統(tǒng)生物信息學(xué)方法篩選和鑒定輻射敏感基因的基礎(chǔ)上[7-9]，進(jìn)一步明確性別和年齡對(duì)離體人外周血中輻射敏感基因(CDKN1A、BAX、MDM2、XPC、PCNA、FDXR、GDF-15、DDB2、TNFRSF10B、PHPT1、ASTN2、RPS27L、BBC3、TNFSF4、POLH、CCNG1、PPM1D和GADD45A)mRNA表達(dá)水平變化的影響，為建立用于快速、準(zhǔn)確估算輻射生物劑量的基因組合表達(dá)模型奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

肝素鋰抗凝真空采血管購于美國BD公司，RNAprep Pure血液總RNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo Fisher公司，NuHiTMRobostic SYBR Green購于蘇州新海生物科技股份有限公司，Taq聚合酶，DEPC水購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，NanoDrop 2000紫外分光光度儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 研究對(duì)象選擇非放射工作人員，近期無急性感染史，無高血壓和糖尿病等慢性疾病史，無吸煙史，無化學(xué)毒物接觸史以及近半年內(nèi)無射線接觸史的30名健康志愿者。男女各15人，年齡20～60歲，平均年齡為(39.03±12.58)歲，男女年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中20～29歲8人，30～39歲8人，40～49歲8人，50～60歲6人。每名志愿者采集靜脈血12 mL，平均分裝至8個(gè)4 mL肝素鋰抗凝真空采血管內(nèi)備用。本研究經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理審查號(hào)LLSC2016-014)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2.2 照射條件和細(xì)胞培養(yǎng)將已分裝的血樣在北京師范大學(xué)于室溫下進(jìn)行60Co γ射線照射。源靶距為73.5 cm，平均照射野為30 cm×30 cm。劑量率為1 Gy/min，劑量分別0、0.5、1、2、3、4、6和8 Gy(0 Gy為陰性對(duì)照組)。照射完畢后，將每個(gè)劑量的血樣接種于含有8 mL 10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中(每瓶約含1.5 mL全血)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.2.3 細(xì)胞總RNA提取與cDNA合成收集細(xì)胞，按照RNAprep Pure血液總RNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書提取總RNA，然后通過NanoDrop 2000紫外分光光度儀測(cè)定純度[D(260)/D(280)為1.8～2.0]并定量。然后應(yīng)用高容量反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，取100～200 ng RNA，加入20 μL的反應(yīng)體系中，經(jīng)25℃、10 min，37℃、120 min，85℃、5 min后終止反應(yīng)，-20℃冰箱保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR引物合成根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫的基因信息，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)定量PCR的18個(gè)輻射敏感基因(CDKN1A、BAX、 MDM2、XPC、PCNA、FDXR、GDF-15、DDB2、TNFRSF10B、 PHPT1、 ASTN2、 RPS27L、 BBC3、TNFSF4、POLH、CCNG1、PPM1D和GADD45A)以及內(nèi)參基因β-actin和B2M的引物序列。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×SYBR green I，2 μL cDNA模板，上下游引物共0.5 μL和7.5 μL雙蒸水。反應(yīng)條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，72℃、45 s，40個(gè)循環(huán)，72℃、10 min。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣，在每次實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)后進(jìn)行熔解曲線分析，以排除引物二聚體的影響，同時(shí)設(shè)立無引物空白對(duì)照組，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，

1.2.6 數(shù)據(jù)處理利用Applied Biosystems 7500 Sequence Detection Software(SDS)進(jìn)行結(jié)果分析。用法，以β-actin和B2M為內(nèi)參基因，相對(duì)定量18個(gè)輻射敏感基因在各照射劑量的mRNA表達(dá)水平變化 。 其 中 ， 內(nèi) 參 基 因 CT值

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平以 xˉ±s表示，采用GraphPad Prism 5.00軟件對(duì)各個(gè)基因的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行一元線性回歸分析并作圖，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行組間比較，各照射劑量組與對(duì)照組、男性組和女性組、以及4個(gè)年齡組間(20～29歲、30～39歲、40～49歲和50～60歲)的輻射敏感基因mRNA表達(dá)水平變化的差異，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 60Co γ射線誘導(dǎo)離體人外周血18個(gè)輻射敏感基因mRNA表達(dá)水平的變化

0.5 ～8 Gy60Co γ射線照射30名正常人離體外周血，熒光定量PCR分析照射后12 h輻射敏感基因的mRNA表達(dá)水平變化。結(jié)果見圖1，可見與未受照組(0 Gy)相比，18個(gè)輻射敏感基因(CDKN1A、BAX、MDM2、 XPC、 PCNA、 FDXR、 GDF-15、 DDB2、TNFRSF10B、 PHPT1、 ASTN2、 RPS27L、 BBC3、TNFSF4、POLH、CCNG1、PPM1D和GADD45A)的mRNA在照后各劑量的相對(duì)表達(dá)水平均明顯增加，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(R2=0.63～0.97，P＜0.05)。

輻射敏感基因的mRNA表達(dá)水平變化在不同個(gè)體間具有一定的差異性。在相同照射劑量，不同個(gè)體間MDM2、 XPC、 FDXR、 DDB2、 ASTN2 和 TNFSF4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平最大可相差5倍以上(見圖2)，特別是FDXR和TNFSF4兩個(gè)基因雖然對(duì)電離輻射反應(yīng)較為敏感并且具有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，但在不同個(gè)體間，兩基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平可相差十幾倍至幾十倍(圖2C、F)。其他基因的mRNA表達(dá)水平在不同個(gè)體間的差異約為2～4倍。

2.2 性別對(duì)輻射敏感基因mRNA表達(dá)水平變化的影響

分析性別對(duì)輻射誘導(dǎo)的基因mRNA表達(dá)變化的影響。結(jié)果顯示，男性和女性外周血中大多數(shù)基因在受到電離輻射作用后的mRNA相對(duì)表達(dá)水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但不同劑量60Co γ射線誘導(dǎo)的BAX、 TNFRSF10B、 ASTN2、 TNFSF4、 POLH 和GADD45A mRNA表達(dá)水平變化均高于男性(P＜0.05或P＜0.01)(見圖 3)。其中，在 0.5～8 Gy劑量范圍內(nèi)，ASTN2和TNFSF4兩個(gè)基因在女性外周血的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于男性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)(圖3C、D)。

2.3 年齡對(duì)輻射敏感基因mRNA表達(dá)水平變化的影響

通過對(duì)四個(gè)年齡組間各輻射敏感基因mRNA表達(dá)水平變化的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3～8 Gy劑量范圍內(nèi)，30～39歲年齡組MDM2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于其他 3 個(gè)年齡組(P＜0.05 或 P＜0.01)(圖 4A)；1～8 Gy60Co γ射線誘導(dǎo)的FDXR mRNA相對(duì)表達(dá)水平與年齡呈負(fù)相關(guān)，即隨著年齡的增長，該基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平逐漸下降，其中20～29歲和30～39歲分別與40～49歲和50～60歲年齡組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)(圖4B)；此外，離體人外周血在受到0.5～8 Gy照射后，DDB2 mRNA在20～29歲和30～39歲兩個(gè)年齡組的相對(duì)表達(dá)水平高于40～49歲和50～60歲年齡組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)(圖4C)； 照 射 2 Gy 和 6～8 Gy 后 ， 20～29 歲 年 齡 組RPS27L mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于30～39歲和40～49歲年齡組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)(圖4D)。輻射誘導(dǎo)的其他基因的mRNA表達(dá)水平變化在4個(gè)年齡組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 60Co γ射線照射離體人外周血輻射敏感基因mRNA表達(dá)水平的變化

3 討論

在大范圍核與輻射恐怖襲擊事件中，快速、有效、準(zhǔn)確的生物劑量估算對(duì)傷員的分類診斷與醫(yī)學(xué)救治是至關(guān)重要的。與非穩(wěn)定性染色體畸變分析相比，通過應(yīng)用先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)輻射誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化進(jìn)行快速、高通量的檢測(cè)與分析，非常適合于大規(guī)模人群受到電離輻射作用后的劑量估算[11-13]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用60Co γ射線照射離體人外周血，實(shí)時(shí)定量PCR方法定量分析18個(gè)輻射敏感基因的mRNA表達(dá)水平改變，同時(shí)分析基因表達(dá)的個(gè)體差異性，以及性別和年齡因素對(duì)基因表達(dá)的影響。

圖2 60Co γ射線照射離體人外周血輻射敏感基因mRNA表達(dá)水平變化的個(gè)體間差異

圖4 60Co γ射線照射后不同年齡組間輻射敏感基因mRNA表達(dá)變化

本研究對(duì)30名正常人離體外周血給予0～8 Gy60Co γ射線照射，發(fā)現(xiàn)人外周血中的18個(gè)輻射敏感基因的mRNA表達(dá)水平在照后12 h均隨受照劑量的增加而增加，劑量-效應(yīng)關(guān)系呈現(xiàn)良好的線性依賴性，這與之前已報(bào)道的研究結(jié)果基本一致，提示這些基因滿足成為輻射生物劑量計(jì)的基本條件[14]。放射生物劑量學(xué)中，個(gè)體對(duì)電離輻射反應(yīng)的差異性是影響準(zhǔn)確估算生物劑量的關(guān)鍵因素[15]。本研究對(duì)30名正常人外周血在受到不同劑量照射后各基因mRNA表達(dá)水平變化的個(gè)體間差異進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在相同劑量，不同個(gè)體之間的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平均存在一定的變動(dòng)性；特別是TNFSF4和FDXR兩個(gè)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平在不同個(gè)體間的差異最大，在特定劑量可高達(dá)10倍或幾十倍，這一結(jié)果與之前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相一致。如Manning等應(yīng)用0.5～4 Gy X射線照射離體人外周血，結(jié)果表明輻射誘導(dǎo)的FDXR、DDB2和CDKN1A mRNA表達(dá)水平變化在相同劑量、不同受照個(gè)體之間均具有高于5倍的個(gè)體差異性[14]。研究表明，人外周血中基因表達(dá)水平廣泛地存在差異性，這種差異可以通過遺傳連鎖方式進(jìn)行定位[16]。Correa等用淋巴細(xì)胞株探索輻射誘導(dǎo)的基因表達(dá)改變的個(gè)體差異性，發(fā)現(xiàn)FDXR和CDKN1A mRNA表達(dá)水平在同卵雙生雙胞胎中也存在較大的差異性[17]。在另一項(xiàng)研究中，應(yīng)用體外照射人外周血白細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的輻射敏感基因CDKN1A、GADD45A和DDB2，在全身照射的腫瘤患者中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出相似的輻射效應(yīng)，但在不同患者中，所有基因都表現(xiàn)出了不同程度的個(gè)體差異性[18-20]，提示輻射誘導(dǎo)基因表達(dá)的個(gè)體差異性反應(yīng)了不同個(gè)體對(duì)于輻射損傷反應(yīng)的敏感性，這為輻射遠(yuǎn)期效應(yīng)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了依據(jù)。

研究表明，基因表達(dá)的個(gè)體差異性主要與性別、年齡、吸煙、生活方式以及炎癥反應(yīng)等因素相關(guān)[6，21]。本研究主要對(duì)性別和年齡兩個(gè)主要因素對(duì)輻射誘導(dǎo)基因表達(dá)變化的影響進(jìn)行了分析。本研究結(jié)果表明離體照射的女性外周血中大多數(shù)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平要高于男性，表明女性的輻射敏感性要高于男性。其中TNFSF4基因已被很多研究證明具有較強(qiáng)的輻射響應(yīng)[4]，本研究發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)TNFSF4 mRNA表達(dá)水平的變化是受性別因素所影響的，0～8 Gy60Co γ射線照后12 h，該基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平隨受照劑量的增加而增加，特別是在女性人群中各劑量的表達(dá)水平明顯高于男性人群，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，GADD45A mRNA在受到較大劑量(＞3 Gy)照射后不同性別人群的相對(duì)表達(dá)水平存在差異。Tavakoli等應(yīng)用0.5～4 Gy相同射線照射6名正常人外周血，同樣發(fā)現(xiàn)＞2 Gy劑量照射后女性外周血樣本中GADD45A mRNA表達(dá)水平明顯高于男性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果相一致[19]。有研究應(yīng)用小鼠全身照射模型，發(fā)現(xiàn)電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷、DNA甲基化、細(xì)胞增殖和凋亡等生物過程具有較明顯的性別特異性，這主要與性激素，特別是雌激素的分泌水平密切相關(guān)[22-23]。上述研究結(jié)果表明利用輻射敏感基因進(jìn)行劑量估算時(shí)，應(yīng)該充分考慮性別因素對(duì)其準(zhǔn)確性的影響。在年齡因素方面，本研究發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)基因的mRNA表達(dá)水平存在年齡組間差異，其中FDXR基因表達(dá)是受年齡影響最大的基因。國外很多研究小組對(duì)輻射誘導(dǎo)FDXR基因表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行了研究，被認(rèn)為是人外周血中比較穩(wěn)定的輻射生物劑量標(biāo)志物。有研究表明，應(yīng)用體外照射人外周血FDXR基因的劑量-效應(yīng)曲線可以較準(zhǔn)確估算≤2 Gy的受照劑量[6，24-26]。目前，國內(nèi)對(duì)該基因的研究較少，本研究結(jié)果證實(shí)FDXR mRNA在受到電離輻射誘導(dǎo)后，照后各時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，但1～6 Gy射線照后12 h，該基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈現(xiàn)隨年齡增長而逐漸下降的趨勢(shì)，其中20～29歲和30～39歲之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩年齡組分別與40～49歲和50歲以上年齡組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明輻射誘導(dǎo)FDXR mRNA表達(dá)水平受年齡因素影響。Kajimura等對(duì)229名日本原爆人群進(jìn)行雙著絲粒細(xì)胞數(shù)以及相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的聚類分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者均呈現(xiàn)隨年齡增加而減少的趨勢(shì)[27]，提示受照者的年齡可能影響輻射誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平變化，其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)輻射誘導(dǎo)的人外周血中輻射敏感基因mRNA表達(dá)水平變化的相關(guān)影響因素進(jìn)行了初步分析，提示輻射敏感基因mRNA表達(dá)變化存在一定的個(gè)體間差異，這可能與受照者的性別和年齡有關(guān)，提示應(yīng)用單一輻射敏感基因?qū)κ苷丈鋭┝窟M(jìn)行估算時(shí)具有很大的不確定性。因此，下一步將建立用于估算生物劑量的基因組合表達(dá)模型，以盡可能消除相關(guān)因素的影響，進(jìn)而提高輻射生物劑量估算的準(zhǔn)確度。