克羅諾桿菌分子分型及毒力機(jī)制研究進(jìn)展

閆 瑞，鈕 冰，楊捷琳*

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

克羅諾桿菌屬（Cronobacterspp.），原阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），隸屬于腸桿菌科，由7 個(gè)種和3 個(gè)亞種組成[1-3]。屬內(nèi)菌株不同分型種類與臨床相關(guān)性存在較大差異，其中多數(shù)臨床分離株為阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii）和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌（C. malonaticus）。據(jù)報(bào)道，多數(shù)菌株易感染嬰幼兒和老年人等免疫力低下人群，可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病（壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥和腦膜炎），且致死率非常高（40%～80%）[4-6]。隨著克羅諾桿菌在不同食品尤其是嬰幼兒配方奶粉中被檢出，嬰幼兒配方奶粉（powdered infant formula，PIF）的污染因與疾病爆發(fā)密切相關(guān)而受到食品和衛(wèi)生監(jiān)管部門的高度重視[7-8]。

至今，分類學(xué)依舊是關(guān)于克羅諾桿菌研究的主題，因?yàn)闇?zhǔn)確的細(xì)菌分類對(duì)于可靠的監(jiān)管控制至關(guān)重要，而準(zhǔn)確的細(xì)菌分類則依賴于有效的分型方法。同時(shí)，無論是克羅諾桿菌的流行病學(xué)研究還是分子溯源方法的建立都必須基于對(duì)目標(biāo)生物多樣性的透徹理解。盡管研究人員已從食品、環(huán)境和臨床上分離到大量菌株，也對(duì)其分類有了較為清晰的認(rèn)識(shí)；但是隨著越來越多克羅諾桿菌全基因組測(cè)序的完成，研究發(fā)現(xiàn)過去基于單個(gè)或多個(gè)基因的分型方法誤將許多無關(guān)菌株劃分到了一起[9-10]。因此利用全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)并采用合適的分型方法來準(zhǔn)確地鑒定和快速識(shí)別不同來源的克羅諾桿菌顯得尤為重要。此外，在克羅諾桿菌流行病學(xué)與毒力機(jī)制研究方面發(fā)現(xiàn)，菌株間致病性存在較大差異，毒力具有多樣性，致病機(jī)制復(fù)雜多變[11-14]。進(jìn)一步深入研究克羅諾桿菌屬內(nèi)各菌株的致病機(jī)制，從分子角度闡明相關(guān)致病機(jī)制和毒力特征，并選用合適的動(dòng)物模型對(duì)該屬菌株進(jìn)行毒力驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)是當(dāng)前克羅諾桿菌研究的主要方向之一。

1 克羅諾桿菌分型方法

克羅諾桿菌的分型方法對(duì)于克羅諾桿菌的分類學(xué)研究起到至關(guān)重要的作用。從最初的Farmer[15]、Iversen[16]等采用表型分型方法建議將黃色陰溝腸桿菌改名為阪崎腸桿菌，并依據(jù)生化譜將實(shí)驗(yàn)菌株劃分為15 個(gè)生物群，后擴(kuò)展至16 個(gè)生物群；再到2007年—2008年Iversen等[1-2]采用多種新的分型方法（DNA-DNA雜交、核糖體分型和全長16S rRNA基因序列分析等）建議建立一個(gè)新屬即克羅諾桿菌屬代替先前的單一物種阪崎腸桿菌。這一新屬當(dāng)時(shí)由5 個(gè)新種、1 個(gè)基因種（Cronobacter genomospecies1）組成。直到Joseph等[3]進(jìn)一步結(jié)合基于7 個(gè)管家基因的分型方法建議將C. genomospecies1命名為C. universalissp. nov.（尤尼沃斯克羅諾桿菌新種），其同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的種C. condimentisp. nov.（康迪蒙提克羅諾桿菌新種），最終形成了包含7 個(gè)種的克羅諾桿菌屬?？肆_諾桿菌分類地位變化并不僅僅依賴于1 種新的分型方法，而是多種傳統(tǒng)分型方法與新分型方法的結(jié)合應(yīng)用（表1）。這些分型方法不僅為克羅諾桿菌的準(zhǔn)確分類提供了依據(jù)，同時(shí)也為克羅諾桿菌的分子溯源及毒力機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

表 1 克羅諾桿菌分類地位變化及分型方法Table 1 Changes in taxonomic status of Cronobacter and typing methods

1.1 生物分型

最初，F(xiàn)armer等[15]采用DNA雜交、生化測(cè)試、黃色菌落產(chǎn)物以及抗生素敏感性等系列方法對(duì)57 株阪崎腸桿菌進(jìn)行分類實(shí)驗(yàn)，建議將“黃色陰溝腸桿菌”更名為阪崎腸桿菌，并建議將其另立為腸桿菌屬下的一個(gè)新種。同時(shí)基于10 個(gè)生化測(cè)試定義了15 個(gè)克羅諾桿菌生物群，并用于菌株的形態(tài)鑒定和區(qū)分。然而，基于DNA序列的方法所描述的菌株形態(tài)表明，這種生物分型方法存在嚴(yán)重缺陷，僅有不超過50%的菌株被正確分配到克羅諾桿菌[16]。因此，生物分型方法對(duì)于菌株的形態(tài)鑒定及準(zhǔn)確定義被認(rèn)為是不可靠的。此外，生物群與單獨(dú)的克羅諾桿菌種之間也沒有準(zhǔn)確的相關(guān)性。盡管生理生化分型方法存在較多弊端，但因其普遍的適用性和基礎(chǔ)的鑒定能力，可作為經(jīng)典的分析方法。目前研究人員主要利用API 20E生化鑒定系統(tǒng)來進(jìn)行生化分型，該方法基于多種不同的生理生化指標(biāo)能夠?qū)⒖肆_諾桿菌鑒定至屬的水平，若要鑒定至種的水平則需要進(jìn)一步增加生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型

早期在對(duì)克羅諾桿菌感染的流行病學(xué)分析中，使用兩種限制性酶（XbaI和SpeI）的脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是最常用的溯源分型方法[6,17,21]。常用于奶粉和嬰幼兒配方奶粉中微生物污染源的追蹤[22-25]，該方法穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)，應(yīng)用基礎(chǔ)廣泛扎實(shí)，但該方法仍存在不能鑒定菌株和無法確定菌株的相關(guān)性；另外，由于固有DNA酶的活性使得某些菌株不能生成具有明顯特征的PFGE圖譜，故不能達(dá)到準(zhǔn)確區(qū)分菌株的目的。因此，PFGE方法正在被逐步取代，全世界的疾病預(yù)防控制中心都正在轉(zhuǎn)向使用全基因組測(cè)序方法作為國際食源性疾病監(jiān)測(cè)分子分型網(wǎng)絡(luò)（https://www.cdc.gov/pulsenet/index.html）監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)，同時(shí)推廣基于全基因組序列的分型方法[26-27]。

1.3 單基因分型

基于序列的細(xì)菌鑒定方法是從單基因座測(cè)序開始的，通常能夠鑒定至種水平。如克諾羅桿菌的16S rRNA、ompA、dnaG、rpsU、cgcA、fliC、rpoB和fusA基因分型[19,28-30]。其中16S rRNA基因因其種間的高度相似性（97.8%～99.7%）而存在一定局限性[20]。2008年，Iversen等[2]發(fā)現(xiàn)C. malonaticussp. nov.并不是C. sakazakii的亞種，主要是因?yàn)?6S rRNA序列分析不能將這兩個(gè)種區(qū)分開，但DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)顯示這兩個(gè)種的DNA相關(guān)性小于70%，所以把生物群1～4、7、8、11和13歸為阪崎克羅諾桿菌，生物群5、9和14劃分到丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌。此外，后續(xù)針對(duì)克羅諾桿菌中的ompA、dnaG和rpoB等基因設(shè)計(jì)的分型方法均存在類似的局限性，一部分費(fèi)時(shí)耗力，一部分則未經(jīng)過涵蓋克羅諾桿菌7 個(gè)種大量菌株的分型驗(yàn)證[31]。其中，fusA等位基因與克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育一致，可用于克羅諾桿菌屬菌種的鑒定。該方法能夠成功地將克羅諾桿菌的7 個(gè)種區(qū)分開，但對(duì)于克羅諾桿菌屬同種菌株間的研究則存在較大限制。

1.4 O-血清分型：gnd和galF基因分析

早期的血清分型方法是使用在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行血清分型，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物可以被設(shè)計(jì)用于O-血清型（rfb基因座）的PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制酶消化以產(chǎn)生可識(shí)別的條帶圖案，血清分型便不再需要使用動(dòng)物。這種方法被許多研究人員用于Cronobacterspp.研究[32-34]。但Sun Yamin等[35]因使用該方法將一些C. malonaticus菌株誤認(rèn)為C. sakazakii，并且錯(cuò)誤地確定了C. sakazakii的血清型。其次，可能由于O-血清型中的變體區(qū)域發(fā)生在PCR引物的目標(biāo)區(qū)域之外，故PCR檢測(cè)分型并不能覆蓋所有C. sakazakii所產(chǎn)生的O-血清型的擴(kuò)增產(chǎn)物[32-33]。因此O-血清型分型的PCR-引物方法逐漸被位于rfb區(qū)域側(cè)面的等位基因gnd和galF的分析方法所取代，這種基于DNA序列的方法用于確定O-血清型則更可靠，操作也更簡便，同時(shí)增加了克羅諾桿菌中可定義血清型的數(shù)量范圍（24～34 種）[36]。

1.5 多位點(diǎn)序列分型

MLST主要是將能夠反映全基因組系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的多個(gè)看家基因的測(cè)序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中已登記數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析從而獲得相應(yīng)序列型。該方法能夠?qū)⒏叨认嗨频木赀M(jìn)行有效區(qū)分?？肆_諾桿菌MLST通常需要7 個(gè)管家基因：atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA。這些基因座最初是用特別設(shè)計(jì)的引物單獨(dú)測(cè)序的，所需成本非常高。隨著下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）的發(fā)展，使得全基因組測(cè)序成本的大大降低，同時(shí)促進(jìn)了克羅諾桿菌基因序列數(shù)據(jù)庫（Pub-MLST）的建立和發(fā)展[9,31,37]。Forsythe[9]和Ogrodzki等[10]詳細(xì)綜述了1 600多株克羅諾桿菌的MLST結(jié)果。截止2018年11月5日，在數(shù)據(jù)庫中分離菌株已達(dá)2 600多株，這些克羅諾桿菌屬內(nèi)菌株的詳細(xì)測(cè)序數(shù)據(jù)（來源、分布、菌種構(gòu)成、序列類型和克隆復(fù)合物等）和研究進(jìn)展均可在線獲得（http://pubmlst.org/cronobacter/）。

對(duì)于克羅諾桿菌屬各菌株之間的研究，MLSA已被證實(shí)是一個(gè)非常有用工具。2009年Baldwin等[18]利用MLSA成功將C. sakazakii和C. malonaticus兩個(gè)種區(qū)分開。此外，MLST顯示C. sakazakiiST4菌株為優(yōu)勢(shì)菌株（22/60）。2012年Joseph等[19]采用MLST方法對(duì)325 株克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)一步證實(shí)了7 個(gè)種的存在，同時(shí)發(fā)現(xiàn)種內(nèi)變異從C. sakazakii的低多樣性到一些種的廣泛多樣性，從而推測(cè)物種之間可能存在基因轉(zhuǎn)換。此外，還發(fā)現(xiàn)C. sakazakii是臨床來源的優(yōu)勢(shì)菌種，C. sakazakiiST4是腦膜炎病例腦脊液分離株的主要序列類型。2014年Forsythe等[9]通過采用更具辨別力的編碼核糖體蛋白基因的多位點(diǎn)序列分析（ribosomal-MLST，rMLST）和基于直系同源基因簇核心基因的多位點(diǎn)序列（clusters of orthologous genes-core gene MLST，COG-cgMLST）分析方法對(duì)107 個(gè)克羅諾桿菌全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)一步證實(shí)C. sakazakiiCC4克隆譜系非常穩(wěn)健。盡管MLST克隆識(shí)別對(duì)于克羅諾桿菌病原體的鑒定是有效的，但它對(duì)于微生物溯源可能會(huì)因相同序列類型（senquence type，ST）當(dāng)中包含大量不相關(guān)菌株（地理來源、分離時(shí)間、宿主等）而適得其反[31]。這一點(diǎn)在COG-cgMLST分析結(jié)果的ST4聚類中也能夠得到印證，其中ST4包含了大量不相關(guān)菌株，這或許是該聚類存在大量分枝的原因。另外，這或許也可以解釋不相關(guān)的臨床C. sakazakii菌株卻具有相同的PFGE脈沖型這一現(xiàn)象。為了解決這一問題，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）分型在近幾年已被應(yīng)用于相同ST的Cronobacter.spp.全基因組研究中。

1.6 SNP分型

單核苷酸多態(tài)性能夠反映分離株之間相當(dāng)大的系統(tǒng)發(fā)育距離，Masood等[38]采用基于全基因組序列的SNP分型技術(shù)對(duì)1994年法國新生兒重癥監(jiān)護(hù)中心的C. sakazakii相同ST菌株進(jìn)行了溯源分析，其結(jié)果顯示SNP分型方法可以對(duì)相同序列型菌株進(jìn)一步分型，來自不同基因型簇的阪崎腸桿菌分離株具有共感染新生兒的能力，然而爆發(fā)來源尚未確定。此外，Guo Qingyan等[39]也通過類似方法對(duì)源自乳品的32 株C. sakazakiiST13菌株進(jìn)行溯源分析，發(fā)現(xiàn)雖然部分C. sakazakiiST13菌株表現(xiàn)出地理位置的聚簇性，但整體來看SNP聚簇與原產(chǎn)地及乳制品產(chǎn)品類型之間沒有明顯的相關(guān)性。雖然SNP分型方法具有高度分辨性，但對(duì)參考菌株的選取較為敏感，即選取不同參考菌株SNP分型結(jié)果存在差異。SNP分析為計(jì)算密集型，因此可能分析時(shí)間較長。對(duì)于分析大型序列集，必須訪問高性能計(jì)算。此外，應(yīng)用該方法進(jìn)行分析需要大量的生物信息學(xué)知識(shí)[27]。

1.7 CRISPR-cas分型

CRISPR-cas陣列反映了菌株對(duì)噬菌體和質(zhì)粒的暴露，通常，CRISPR-cas系統(tǒng)可具有多達(dá)3 個(gè)區(qū)段：cas基因、陣列上游的富含AT的前導(dǎo)序列、由兩個(gè)重復(fù)序列（24～48 個(gè)核苷酸）組成且中間插入長度相似的間隔區(qū)的短CRISPR陣列，這些間隔區(qū)通常來自移動(dòng)遺傳區(qū)，如噬菌體和質(zhì)粒等。間隔物在引導(dǎo)端依次添加，并且給定的間隔物具有高度特異性。由于對(duì)噬菌體和質(zhì)粒的不同暴露，CRISPR-cas陣列在密切相關(guān)的菌株之間可能不同，導(dǎo)致間隔序列的變化。這些基因座可用作分子亞型的替代靶標(biāo)，并且可提供比MLST（7 個(gè)位點(diǎn)）和PFGE更高的菌株分辨率。因此，該方案可能是對(duì)于高克隆生物如克羅諾桿菌有用的分型工具[10,31]。Ogrodzki等[40]曾將CRISPR-cas陣列應(yīng)用于分析C. sakazakii4 個(gè)致病型：CC1、CC4、ST8和ST12。結(jié)果顯示該方法能夠根據(jù)菌株的間隔基因陣列將同一ST中的菌株進(jìn)行區(qū)分。此外，他們進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于克羅諾桿菌其余6 個(gè)種相同序列型菌株的研究，并證明了CRISPR-cas分析用于流行病學(xué)目的有用性。

隨著克羅諾桿菌全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的增加，一方面使得Pub-MLST數(shù)據(jù)庫中菌株ST、CC數(shù)據(jù)大規(guī)模增加；另一方面也使得對(duì)大量相同序列型菌株進(jìn)行更全面的全基因組比較分析成為可能。這不僅有助于克羅諾桿菌屬內(nèi)相同ST菌株的進(jìn)一步細(xì)分，而且有利于大量的毒力因子的揭示，從而為該菌的毒力機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

2 克羅諾桿菌毒力機(jī)制

最初克羅諾桿菌因與新生兒感染相關(guān)而被人們所關(guān)注，現(xiàn)已被公認(rèn)為主要引起成人感染?？肆_諾桿菌屬的7 個(gè)種可根據(jù)其臨床相關(guān)性進(jìn)行分組：第1組包括C. sakazakii和C. malonaticus，構(gòu)成了所有年齡組的大多數(shù)臨床分離株；第2組包括C. turicensis和C. universalis，很少被報(bào)道；其他3 種C. dublinensis、C. muytjensii和C. condimenti主要是環(huán)境共生物，可能很少或沒有臨床意義。因此，克羅諾桿菌毒力機(jī)制的研究主要集中于C. sakazakii和C. malonaticus[9,12,36,41-45]。其中，與特定新生兒和成人感染相關(guān)的致病型分別是：C. sakazakiiCC4、ST12與新生兒感染有關(guān)，C. malonaticusCC7與成人感染相關(guān)。其他的潛在致病性研究，如分離自嬰幼兒配方奶粉的C. sakazakiiST83菌株通過感染斑馬魚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其致死率非常高（90%～100%）[14]。過去，開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通常選用的菌株為C. muytjensiiATCC 51329T，這是前阪崎腸桿菌物種的PreceptrolTM菌株[46]。然而，鮮有報(bào)道關(guān)于該物種的臨床病例，因此研究的相關(guān)性尚不確定。近期也有研究人員通過采用全基因組測(cè)序的方法針對(duì)代表性菌株如C. sakazakiiBAA-894進(jìn)行致病性和毒力特征的深入研究。

2.1 流行病學(xué)

由于發(fā)達(dá)國家和一些發(fā)展中國家的報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)不同，甚至?xí)霈F(xiàn)漏報(bào)的情況，造成感染病例較少、病例報(bào)告不足的現(xiàn)狀，以至于目前克羅諾桿菌的流行病學(xué)仍是不完整的、模糊不清的?，F(xiàn)已知患病新生兒的主要癥狀有壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥和腦膜炎。前者是非侵入性的，而在敗血癥和腦膜炎中，病原體可能通過腸上皮層細(xì)胞附著并侵入宿主。同時(shí)，關(guān)于C. sakazakiiCC4在新生兒腦膜炎病例中占主導(dǎo)地位的原因尚不清楚，這可能與該克隆譜系菌株的環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)及潛在的毒力因子有關(guān)。C. sakazakiiCC4菌株已從嬰兒配方奶粉[22,24,47-50]和多數(shù)國家的奶粉生產(chǎn)廠中分離出來，因此可能代表一種穩(wěn)定持久的變異菌株，導(dǎo)致了新生兒感染的增加。C. sakazakiiST12與壞死性小腸結(jié)腸炎病例有關(guān)而非新生兒腦膜炎或敗血癥[38]。需要注意的是，NEC是新生兒常見的多因素胃腸道疾病，它不單與Cronobacterspp.有關(guān)，可由多種細(xì)菌病原體引起。關(guān)于成人的克諾羅桿菌感染報(bào)道指出[9,44]，C. malonaticusCC7似乎與成人病例相關(guān)。成人的克羅諾桿菌感染表現(xiàn)出多種癥狀：結(jié)膜炎、膽汁性敗血癥、尿膿毒癥、闌尾炎、傷口感染和肺炎?？赡苡捎谘X屏障的成熟，成人病例較少發(fā)生敗血癥和腦膜炎。另外，成人感染的來源尚不明確，發(fā)病率增加的原因也尚不清楚。

2.2 致病性和毒力因子

目前關(guān)于克羅諾桿菌感染所引發(fā)的高死亡率的詳細(xì)機(jī)制仍然知之甚少，其中阪崎克羅諾桿菌主要毒力因子和感染致病機(jī)制模型可參見圖1[12]。

如圖1所示，該致病菌能夠編碼多個(gè)與致病過程密切相關(guān)的毒力因子，這些毒力因子在包括黏附于宿主表面、穿過、侵入和破壞腸上皮細(xì)胞內(nèi)的腸屏障等致病過程中起到了重要的作用。據(jù)報(bào)道，阪崎克羅諾桿菌不僅能夠從宿主細(xì)胞頂端侵入，而且也能夠從基底外側(cè)侵入，從而轉(zhuǎn)移到大鼠更深的器官（脾臟和肝臟）[51-52]。由于克羅諾桿菌的致病研究還比較分散，沒有形成系統(tǒng)性。因此，克羅諾桿菌毒力因子列表僅列舉了部分與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的主要毒力因子（表2）。

圖 1 假設(shè)的阪崎克羅諾桿菌感染和發(fā)病機(jī)制模型[12]Fig. 1 Proposed model for Cronobacter sakazakii infection and pathogenesis[12]

2.3 外膜蛋白

克羅諾桿菌可以侵入人體腸道細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞中復(fù)制，并侵入血腦屏障[51-52]。體外研究表明，克羅諾桿菌在對(duì)哺乳動(dòng)物腸細(xì)胞的附著和侵襲，巨噬細(xì)胞中的存活率及對(duì)血清的抗性方面與E. cloacae（陰溝腸桿菌）和Citrobacter freundii（弗氏檸檬酸桿菌）相當(dāng)，但是低于Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）。外膜蛋白A（OmpA）和外膜蛋白X（OmpX）可能在克羅諾桿菌穿透血腦屏障中起作用，盡管導(dǎo)致腦細(xì)胞破壞的機(jī)制尚不清楚，并且部分可能是宿主反應(yīng)[53-54]。C. sakazakii產(chǎn)生的外膜囊泡，可能會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變作用[55]。近期，也有研究人員通過基因芯片技術(shù)來研究與外膜蛋白致病密切相關(guān)的外膜囊泡。結(jié)果顯示，外膜囊泡可能參與外膜蛋白的包裝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程[56]。

2.4 唾液酸的利用

C. sakazakii和一些C. turicensis菌株可以利用外源唾液酸作為生長的碳源，這或許具有臨床意義。這可能是一個(gè)主要的進(jìn)化宿主適應(yīng)機(jī)制，因?yàn)橥僖核岽嬖谟谀溉?、黏蛋白和神?jīng)節(jié)苷脂中[57]。由于唾液酸與大腦發(fā)育相關(guān)，因此其也是嬰幼兒配方奶粉的一種成分。C. sakazakii也能夠在神經(jīng)節(jié)苷脂GM1上生長，其中唾液酸是唯一的碳源[58]。

2.5 質(zhì)粒攜帶的毒力因子

質(zhì)粒攜帶的毒力因子是一種重要的潛在毒力因子，如克羅諾桿菌纖溶酶原激活物（Cronobacterplasminogen activator，CPA），僅在C. sakazakii和C. universalis中編碼一種外膜蛋白酶[59]。另外，Eshwar等[13]進(jìn)行了以斑馬魚為動(dòng)物模型的克羅諾桿菌感染實(shí)驗(yàn)，他們的實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)了RepF1B樣質(zhì)粒在克羅諾桿菌中作為“毒力質(zhì)?！钡淖饔?，同時(shí)鞏固了兩種推定的毒力因子cpa和zpx在體內(nèi)發(fā)病機(jī)制中的重要性。此外，Chase等[14]通過采用全基因組測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析的方法發(fā)現(xiàn)C. sakazakiiH322和其它ST83菌株都存在pESA3-樣毒力質(zhì)粒，其中一株存在pESA2-樣毒力質(zhì)粒，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了pCS1-樣毒力質(zhì)粒。這些結(jié)果表明ST83菌株可能具有高的致病性。

表 2 克羅諾桿菌主要的已知毒力因子特征Table 2 Characteristics of major known virulence factors of Cronobacter

2.6 其他潛在毒力因子

克羅諾桿菌的測(cè)序基因組揭示了一系列的黏附素，如外膜蛋白、外排系統(tǒng)、鐵吸收機(jī)制、溶血素和VI型分泌系統(tǒng)等[60-63]，這可能有助于進(jìn)一步全面了解該菌的毒力機(jī)制。其他候選毒力決定因素包括用于巨噬細(xì)胞存活的超氧化物歧化酶、鞭毛、金屬蛋白酶、腸毒素[52,64-67]。如何選取合適的新生動(dòng)物模型對(duì)上述潛在毒力因子進(jìn)行有效驗(yàn)證是當(dāng)前克羅諾桿菌毒力機(jī)制研究的主要方向之一。

3 結(jié) 語

從克羅諾桿菌的研究歷程來看，克羅諾桿菌的分類地位隨著分型方法的改進(jìn)在不斷的發(fā)生著變化，直到2012年克羅諾桿菌才形成較為明確的分類。近幾年的研究則主要基于這一分類基礎(chǔ)，進(jìn)一步對(duì)不同種菌株進(jìn)行MLST研究，然而通過全基因組測(cè)序和比較基因組分析發(fā)現(xiàn)Pub-MLST數(shù)據(jù)庫已登記的MLST結(jié)果中因包含了大量不相關(guān)菌株而很難將這些分型結(jié)果應(yīng)用于克羅諾桿菌的溯源分析[9-10,30]。同時(shí)，克羅諾桿菌分類形成之前的一些關(guān)于阪崎腸桿菌的毒力機(jī)制研究則需進(jìn)一步的驗(yàn)證。本文著重介紹的分型方法，也是當(dāng)前全基因組分型中較為常用的分析策略。其中API 20E可作為克羅諾桿菌屬的初步鑒定，而PFGE正在被逐步取代轉(zhuǎn)向基于全基因組序列的分型方法?；趩位蛉鏵usA的分型可用于種水平的鑒定，其他單基因分型則有助于對(duì)克羅諾桿菌功能及毒力基因的研究。進(jìn)一步采用基于gnd和galF基因及MLST分型則可獲得更多關(guān)于菌株血清型，ST和CC型信息，從而能夠進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、菌株致病相關(guān)性、流行病學(xué)等研究。在此基礎(chǔ)之上從全基因組層面對(duì)相同ST克羅諾桿菌進(jìn)行深度解析如COG-cgMLST、SNP和CRISPR-cas分析，則可為確定菌株來源、獲取更多與菌株流行病學(xué)特性及毒力因子相關(guān)信息奠定基礎(chǔ)?？肆_諾桿菌的毒力機(jī)制研究尚缺乏統(tǒng)一結(jié)論，研究較為分散。一方面需要我們不斷完善其流行病學(xué)信息，從而獲得更多確切的致病信息；另一方面隨著基因分型的發(fā)展，菌株分類更加清晰，先前與毒力機(jī)制相關(guān)的一些結(jié)果可能存在缺陷需要再次驗(yàn)證。綜上所述，結(jié)合克羅諾桿菌Pub-MLST數(shù)據(jù)庫從全基因組層面對(duì)屬內(nèi)不同來源菌株進(jìn)行剖析，選取合適的新生動(dòng)物模型對(duì)基因測(cè)序揭示的毒力因子進(jìn)行驗(yàn)證，不但可以促進(jìn)該菌的溯源研究，而且對(duì)于詳細(xì)闡明其毒力機(jī)制有著深遠(yuǎn)影響。