黃原膠對體外模擬消化過程中4 種竹葉黃酮生物可及性的影響

李占明，蔡泓歷，梁 奕，毛 豪，廖晗雪，俞 玥*，周冬仁

（1.中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江省漁業(yè)健康與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313001）

現(xiàn)有研究表明，植物來源的天然抗氧化物質(zhì)能夠有效干預(yù)氧化應(yīng)激，對相關(guān)疾病的預(yù)防具有重要意義，是當(dāng)前天然活性物質(zhì)開發(fā)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題[1-3]。植物黃酮類膳食補(bǔ)充劑的攝入對于維持和促進(jìn)人體生理健康具有積極意義[4-5]。研究證實(shí)，谷物黃酮可以明顯抑制由脂質(zhì)體引起的細(xì)胞炎癥，發(fā)揮抗炎作用[6]。同時(shí)，植物黃酮還可以通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)其對氧化損傷的保護(hù)作用[7]。生物可及性是指生物活性物質(zhì)在攝入之后能被機(jī)體吸收的比例，然而，植物黃酮在胃腸道消化中易被降解，導(dǎo)致生物可及性降低，這限制了其生物活性的發(fā)揮[8-9]。生物可及性的提高使活性物質(zhì)得以進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)揮其生物活性[10]。因此，提高植物來源的黃酮類抗氧化物質(zhì)的生物可及性對其產(chǎn)品開發(fā)及生物活性的利用至關(guān)重要。

植物來源的竹葉碳苷黃酮是黃酮類抗氧化劑，因其具有抗炎、抗輻射、抗腫瘤等良好的生物活性，近年來引起廣泛關(guān)注[11]。據(jù)報(bào)道，來源于金剛竹的竹葉抗氧化提取物中主要的標(biāo)志性碳苷黃酮為葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素[12-13]。近來，針對竹葉碳苷黃酮的研究大多集中在其粗提物的抗氧化活性等方面[14-15]，鮮有研究關(guān)注其經(jīng)胃腸道消化后的生物可及性。含碳苷黃酮的食物進(jìn)入口腔，經(jīng)胃腸消化后，剩余部分得以達(dá)到小腸壁，然后經(jīng)被動運(yùn)輸進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[16-17]，在消化過程中，不同消化階段消化液pH值的變化加劇了黃酮的降解[18-19]。目前關(guān)于提升膳食黃酮類物質(zhì)生物可及性的研究有待深入開展。

體外模擬消化模型的應(yīng)用有助于減少實(shí)驗(yàn)動物的使用，便于在體外進(jìn)行相關(guān)的物理、化學(xué)特性研究。相較于體內(nèi)消化研究，體外模擬消化模型具有操作便利、避免倫理學(xué)沖突、低成本、快速等特點(diǎn)，因此，近年來得到了大量的關(guān)注[20-21]。同時(shí)，研究表明，纖維素可以用來提升植物活性物質(zhì)生物可及性。纖維素與生物活性物質(zhì)經(jīng)過物理包覆后，其在消化過程中的降解大大減少，此外，膳食纖維的加入有助于降低胃腸道消化液的通過速度，減少生物活性物質(zhì)的損失[22-23]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，相較于添加羧甲基纖維素鈉、支鏈淀粉、阿拉伯膠等物質(zhì)，在模擬腸道消化時(shí)，添加黃原膠有助于提升竹葉黃酮的生物可及性。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建體外模擬消化模型，系統(tǒng)探究黃原膠對4 種竹葉碳苷黃酮生物可及性的提升作用。同時(shí)，采用主成分分析和聚類分析研究不同的消化液消化階段添加黃原膠后，4 種碳苷黃酮生物可及性的聚類趨勢及不同碳苷黃酮質(zhì)量濃度變化的線性關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹葉 浙江圣氏生物科技有限公司；4 種竹葉黃酮（異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素）標(biāo)準(zhǔn)品為實(shí)驗(yàn)室自制（純度均大于98%）。

黃原膠、α-淀粉酶、膽酸鈉 上海阿拉丁試劑有限公司；福林-酚試劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H2多功能酶標(biāo)儀、離心機(jī) 美國Biotek公司；Acquity超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）系統(tǒng) 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 竹葉碳苷黃酮提取物的制備

干燥竹葉（PhyllostachysSiet. et Zucc leaf）經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液在持續(xù)攪拌下提取3 h[24]，提取物濃縮后進(jìn)行噴霧干燥，得到竹葉提取物粉末，干燥粉末經(jīng)水溶解，8 000×g離心10 min后的溶液用于總酚、總黃酮含量的測定及體外模擬消化實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 總酚含量的測定

總酚含量的測定依據(jù)福林-酚法[25-26]。配制0.1 mg/mL沒食子酸工作溶液。將不同體積（0、20、40、60、80、100、120 μL）的沒食子酸工作溶液加入離心管中，然后加入40 μL福林-酚試劑，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的碳酸鈉溶液80 μL，用去離子水將反應(yīng)液總體積補(bǔ)足至1 mL，暗處反應(yīng)2 h后，將反應(yīng)液加入酶標(biāo)板，每個質(zhì)量濃度4 個重復(fù)，在765 nm波長處測定溶液的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚的含量，結(jié)果以每克干物質(zhì)中沒食子酸當(dāng)量表示。

1.3.3 總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定依據(jù)文獻(xiàn)[27-28]的方法，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以每克干物質(zhì)中兒茶素當(dāng)量表示。

1.3.4 體外消化模型的建立

本研究的消化對象為未經(jīng)消化的20 mg/L竹葉碳苷黃酮提取物（原始樣品）、竹葉碳苷黃酮提取物與黃原膠混合液（兩者質(zhì)量濃度分別為20、16 mg/L）（黃原膠保護(hù)組）和20 mg/L竹葉碳苷黃酮提取物（直接消化組）。原始樣品不做消化處理，作為對照品；將黃原膠保護(hù)組、直接消化組經(jīng)模擬消化后各階段的樣品與原始樣品的竹葉碳苷黃酮質(zhì)量濃度作對比。

口腔、胃、腸道體外消化模型的建立參考文獻(xiàn)[29]。取9 mL樣品溶液，加入1 mLα-淀粉酶，37 ℃孵育10 min后，用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值到2.0，得到模擬口腔消化后的樣品A10（取樣4 個，每個樣品體積500 μL）；在取樣后剩余的A10樣品中加入1 mL胃蛋白酶（10 mg/mL），于37 ℃孵育90 min，然后用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0，得到模擬胃消化后的樣品B90（取4 個樣品，每個體積500 μL）；在取樣后剩余的B90樣品中加入2.5 mL胰蛋白酶（10 mg/mL）和2.5 mL膽酸鈉溶液（50 mg/mL），37 ℃孵育90 min，孵育結(jié)束后，再經(jīng)90～95 ℃水浴10 min，得到模擬腸道消化后的樣品C90（取4 個樣品，每個體積500 μL）。黃原膠保護(hù)組、直接消化組各階段得到的樣品分別標(biāo)記為xA10、xB90、xC90和dA10、dB90、dC90，原始樣品記作O。消化后的樣品冷凍干燥后用UPLC法檢測葉炭苷黃酮質(zhì)量濃度。

1.3.5 4 種竹葉炭苷黃酮質(zhì)量濃度測定

采用UPLC法測定4 種竹葉炭苷黃酮（異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素）的質(zhì)量濃度。未經(jīng)處理的樣品定容后直接測定。直接消化組和黃原膠保護(hù)組樣品經(jīng)冷凍干燥后，加入1 mL甲醇，漩渦混勻后8 000×g離心10 min，上清液用濾膜過濾后進(jìn)行UPLC測定。

測試條件：ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），測定波長為340 nm，進(jìn)樣量為1 μL，流動相A（100%乙腈）、流動相B（體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液）的體積比為80∶20，流速為0.21 mL/min。

1.3.6 生物可及性測定

生物可及性是指物質(zhì)從基質(zhì)釋放到消化道中，有可能被吸附進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)（血管）的比例[30]。生物可及性采用下式計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件，采用One-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用主成分分析和聚類分析研究不同處理樣品的4 種碳苷黃酮質(zhì)量濃度的聚類趨勢，用皮爾遜線性分析法分析4 種碳苷黃酮質(zhì)量濃度變化之間的線性關(guān)系。采用Origin 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉碳苷黃酮總酚、總黃酮含量及UPLC分析結(jié)果

圖 1 竹葉提取物中4 種碳苷黃酮（A）、標(biāo)準(zhǔn)品（B）的UPLC圖譜及分子結(jié)構(gòu)（C）Fig. 1 UPLC of four flavonoid C-glycosides in bamboo leaf extract (A)and standard solutions (B), as well as their structures (C)

提取物中總酚含量為（78.83±1.29）mg/g，總黃酮含量為（79.93±2.08）mg/g。如圖1所示，原始樣品中異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素的質(zhì)量濃度分別為239.25、67.05、58.12、27.04 mg/L。體外消化后的樣品在不同消化階段取樣后冷凍干燥，取干燥后的樣品進(jìn)行UPLC分析。

2.2 體外模擬消化中各階段不同樣品組的竹葉黃酮質(zhì)量濃度

由圖2可知，原始樣品組的4 種碳苷黃酮的質(zhì)量濃度均最高。而直接消化組樣品結(jié)果顯示，口腔、胃、腸道的模擬消化均會造成4 種碳苷黃酮質(zhì)量濃度不同程度地下降，各個消化階段造成的黃酮質(zhì)量濃度下降的趨勢存在差異。與原始樣品相比，模擬口腔消化階段，直接消化組、黃原膠保護(hù)組樣品異葒草苷質(zhì)量濃度分別下降約30%、20%；模擬胃消化階段，直接消化組樣品異葒草苷質(zhì)量濃度下降50%左右，而黃原膠保護(hù)組的異葒草苷質(zhì)量濃度約下降35%；模擬腸道消化階段，直接消化組樣品異葒草苷質(zhì)量濃度下降88%左右，而黃原膠保護(hù)組的異葒草苷質(zhì)量濃度約下降85%。以上結(jié)果表明，直接消化組和黃原膠保護(hù)組樣品在3 個消化階段的異葒草苷質(zhì)量濃度均存在顯著性差異（P＜0.05）。綜合比較3 種體外模擬消化階段發(fā)現(xiàn)，腸道模擬消化對異葒草苷造成的損失最大。對于異牡荊素和牡荊素，模擬腸道消化后，黃原膠保護(hù)組的質(zhì)量濃度分別降低了62%和59%，遠(yuǎn)低于直接消化組（分別降低84%和80%）。所有樣品中4 種黃酮的質(zhì)量濃度均為：異葒草苷＞葒草苷＞異牡荊素＞牡荊素。

圖 2 不同模擬消化階段各樣品中4 種碳苷黃酮的質(zhì)量濃度Fig. 2 Concentrations of four flavonoid C-glycosides at different digestion stages

與直接消化組相比，黃原膠保護(hù)組4 種碳苷黃酮質(zhì)量濃度的下降均顯著減緩（P＜0.05），表明黃原膠的加入有效地降低了4 種碳苷黃酮在體外模擬消化過程中的損失。另外，對黃原膠保護(hù)組不同模擬消化階段的碳苷黃酮質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)腸道模擬消化造成的碳苷黃酮的損失明顯高于口腔模擬消化和胃模擬消化。胃模擬消化后4 種碳苷黃酮質(zhì)量濃度相較于口腔模擬消化后僅輕微下降。本課題組在先前針對果膠的研究中同樣證實(shí)，口腔模擬消化中碳苷黃酮質(zhì)量濃度的損失明顯小于胃腸道模擬消化[22]。腸道模擬消化后竹葉碳苷黃酮的損失明顯高于胃模擬消化，可能的原因是，在消化過程中消化液pH值的變化加劇了碳苷黃酮的分解[31]。在腸道模擬消化階段，黃原膠保護(hù)組4 種竹葉碳苷黃酮的質(zhì)量濃度顯著高于直接消化組（P＜0.05），表明黃原膠對4 種碳苷黃酮存在保護(hù)作用。本研究結(jié)果與先前關(guān)于纖維素可以提升植物活性物質(zhì)生物可及性的研究結(jié)果[23,32]一致。

2.3 體外模擬腸消化后碳苷黃酮質(zhì)量濃度變化的線性關(guān)系

表 1 模擬腸消化后4 種碳苷黃酮質(zhì)量濃度的皮爾遜分析結(jié)果Table 1 Pearson analysis of linear correlations among four flavonoid C-glycosides after intestinal digestion

對模擬腸消化后的4 種碳苷黃酮的質(zhì)量濃度進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示。相關(guān)系數(shù)r值大于0.9，表明有良好的線性關(guān)系，P＜0.05表明線性關(guān)系顯著，P＜0.01表明線性相關(guān)性極顯著。由于P＜0.01，因此4 種碳苷黃酮的質(zhì)量濃度存在極顯著線性相關(guān)性。對4 種碳苷黃酮的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，如圖3所示，4 個重復(fù)的7 種樣品（原始樣品＋3 個階段（口腔、胃、腸道消化）直接消化組樣品＋3 個階段（口腔、胃、腸道消化）黃原膠保護(hù)組樣品）線性擬合結(jié)果顯示，不同樣品的4 種黃酮質(zhì)量濃度之間均存在良好的線性關(guān)系。

圖 3 不同處理組4 種碳苷黃酮質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系Fig. 3 Linear correlations among concentrations of flavonoid C-glycosides

2.4 不同模擬消化階段4 種碳苷黃酮生物可及性的變化

表 2 不同處理樣品中4 種竹葉碳苷黃酮的生物可及性Table 2 Bioaccessibility of four flavonoid C-glycosides in different samples

為了進(jìn)一步揭示黃原膠對碳苷黃酮的保護(hù)作用，對不同體外模擬消化階段4 種碳苷黃酮的生物可及性進(jìn)行了比較（表2）。比較直接消化組樣品的異牡荊素和牡荊素的生物可及性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)模擬腸道消化后，加入黃原膠后異牡荊素的生物可及性提升了140%，牡荊素的生物可及性提升了105%。比較3 個體外模擬消化階段發(fā)現(xiàn)，黃原膠保護(hù)組4 種竹葉碳苷黃酮的生物可及性均高于直接消化組樣品，表明黃原膠處理對胃模擬消化和腸道模擬消化時(shí)黃酮的降解存在保護(hù)作用。綜上，黃原膠的加入提升了體外模擬消化過程中4 種碳苷黃酮的生物可及性。

同時(shí)，比較發(fā)現(xiàn)，黃原膠對異牡荊素和牡荊素的保護(hù)作用明顯強(qiáng)于對異葒草苷和葒草苷的保護(hù)作用，可能是其結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的[33]：異葒草苷和葒草苷是同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)相近，在同樣的體外模擬消化處理環(huán)境中降解程度接近；牡荊素和異牡荊素是同分異構(gòu)體，體外模擬消化對其生物可及性的影響接近。盡管黃原膠保護(hù)組牡荊素和異牡荊素在腸道模擬消化后生物可及性高于直接消化組80%以上，但總體的生物可及性仍需提高，以使其更好地發(fā)揮竹葉碳苷黃酮的生物功效。

2.5 竹葉碳苷黃酮質(zhì)量濃度變化的主成分分析與聚類分析結(jié)果

圖 4 不同處理組碳苷黃酮聚類分析的三維得分圖Fig. 4 Cluster plot of top three principal components for flavonoid C-glycosides in different groups

為進(jìn)一步探究黃原膠的加入對4 種竹葉碳苷黃酮質(zhì)量濃度的影響，對原始樣品、直接消化組樣品、黃原膠保護(hù)組樣品中4 種碳苷黃酮的質(zhì)量濃度進(jìn)行主成分分析。如圖4所示，前3 個主成分（PC1、PC2、PC3）可以代表99.89%的信息。不同處理組樣品呈現(xiàn)不同的聚類趨勢，原始樣品聚為一組，直接消化組樣品聚為一組，黃原膠保護(hù)組樣品聚為一組，表明主成分可以很好地反映樣品信息，各組樣品組內(nèi)的黃酮質(zhì)量濃度變化差異小。對樣品進(jìn)行聚類分析（圖5），結(jié)果顯示，樣品xC90與樣品dC90在歐氏距離平方1.2左右聚為一類，樣品xB90、dB90、xA10與dA10在歐氏距離平方1.3聚為一類，與主成分分析結(jié)果一致，表明模擬消化階段影響4 種竹葉碳苷黃酮質(zhì)量濃度的聚類趨勢。聚類趨勢分析表明，模擬口腔及胃消化與模擬腸道消化時(shí)，不同處理組樣品的4 種竹葉碳苷黃酮質(zhì)量濃度存在差異。

圖 5 不同處理組的聚類分析圖Fig. 5 Cluster analysis of different groups of samples

2.6 黃酮生物可及性變化機(jī)制的分析結(jié)果

研究證實(shí)，淀粉及纖維素等可以在胃腸道消化過程中以成膠或者包覆的形式對植物活性小分子物質(zhì)提供保護(hù)[23,34]。纖維素或者淀粉的分子空腔可以容納小分子的生物活性物質(zhì)，使其抵御消化液消化[35-36]。纖維素分子的物理包覆或者封裝減少了黃酮分子的降解，使其更容易通過消化道壁繼而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮其生物活性[22]。植物黃酮與其他的食品成分混合可以有效地緩解由消化液pH值變化產(chǎn)生的降解，提升其生物可及性。Chen Hua等[37]也證實(shí)了玉米淀粉的支鏈空隙可以容納槲皮素分子，并有望作為小分子活性物質(zhì)的理想載體。圖6為黃原膠分子對竹葉碳苷黃酮分子的保護(hù)作用示意圖，黃原膠分子內(nèi)的氫鍵以及黃原膠分子的交聯(lián)結(jié)構(gòu)形成的空腔可以容納黃酮分子，在消化過程中增加其抵御消化液消化的能力，提升其生物可及性[18-19]。

圖 6 黃原膠提升竹葉提取物中竹葉碳苷黃酮在模擬消化過程中的生物可及性示意圖Fig. 6 Schematic of branch space of xanthan gum for the improvement of bamboo leaf flavonoids bioaccessibility during simulated in vitro gastrointestinal digestion

3 結(jié) 論

本研究利用體外模擬消化模型，結(jié)合UPLC技術(shù)分析竹葉提取物中4 種碳苷黃酮（異葒草苷、葒草苷、異牡荊素和牡荊素）的質(zhì)量濃度變化，探究黃原膠對竹葉碳苷黃酮在消化過程中的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，相較于直接消化組樣品，黃原膠的加入可以顯著減少在模擬消化過程中竹葉碳苷黃酮的降解，利于提升其生物可及性。口腔、胃、腸道模擬消化對竹葉碳苷黃酮的生物可及性影響存在差異，其中腸道模擬消化對直接消化組和黃原膠保護(hù)組樣品的竹葉碳苷黃酮質(zhì)量濃度影響高于口腔和胃模擬消化處理。黃原膠的加入可以提升牡荊素和異牡荊素的生物可及性。綜上，黃原膠有助于提升體外模擬消化過程中竹葉碳苷黃酮的生物可及性，對于相關(guān)功能產(chǎn)品的開發(fā)具有較好的應(yīng)用價(jià)值。