生物保鮮劑對(duì)冷卻肉保鮮的影響

王 盼 何貝貝 李志成* 田娜娜 馬林林

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100 2 西安雨潤(rùn)農(nóng)產(chǎn)品全球采購(gòu)有限公司 西安710000）

肉類(lèi)食品是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢扇鄙俚氖澄?，更是人體所需優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。鮮肉在0～4℃低溫條件下一般只能保存7～9d[1]，而嗜冷性微生物如假單胞菌、腸桿菌等大量繁殖是引起冷卻肉腐敗的主要原因[2]。延長(zhǎng)肉制品保鮮期，可通過(guò)抑制肉制品中微生物生長(zhǎng)和酶的活力，目前冷卻肉最簡(jiǎn)便、最經(jīng)濟(jì)的保鮮技術(shù)是低溫與保鮮劑相結(jié)合[3]?；瘜W(xué)合成保鮮劑是一把雙刃劍，具有較高的防腐保鮮效果，然而，如果長(zhǎng)期大量攝入會(huì)危害人類(lèi)健康。天然防腐保鮮劑主要來(lái)源于動(dòng)植物原料以及利用微生物進(jìn)行發(fā)酵得到的產(chǎn)物，具有純天然、來(lái)源豐富、安全高效、抑菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為冷卻肉保鮮劑研究開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)[4]。復(fù)合生物保鮮劑可發(fā)揮協(xié)同作用，不僅可以達(dá)到很好的抑菌保鮮效果，還能降低單種保鮮劑的用量，降低成本，越來(lái)越受到生產(chǎn)者的青睞[5-7]?，F(xiàn)階段，雖然應(yīng)用在肉類(lèi)保鮮方面的方法各式各樣，但將抗菌肽與天然保鮮劑復(fù)合這種抑菌方式應(yīng)用到肉類(lèi)保鮮方面，鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)中選用乳源抗菌肽，安全、高效且成膜阻氣性及黏性強(qiáng)的殼聚糖[8-9]和普魯蘭多糖[10]，具有抗氧化和抑菌特性的蘋(píng)果多酚[11]和茶多酚[12]以及抗菌效力強(qiáng)、水溶性好、穩(wěn)定性高的納他霉素[13]，ε-聚賴(lài)氨酸[14]、乳酸鏈球菌素（Nisin）等生物保鮮劑，先研究其對(duì)冷卻肉主要腐敗菌的抑制作用，后選取抑菌良好的保鮮劑進(jìn)行復(fù)配，研究其對(duì)冷卻豬肉和羊肉的保鮮效果的影響。研發(fā)新型生物保鮮劑，為冷卻豬肉和羊肉的冷鏈物流及延長(zhǎng)其貨架期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮無(wú)抗山羊乳、牛乳，西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧場(chǎng)；冷鮮原料肉（豬、羊后腿肉），楊凌好又多連鎖超市；大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aures 26111）、沙門(mén)氏菌 （Salmonella LT2）、腸球菌（Enterococcus faecalis ATCC 29212）、假 單胞菌（Pseudomonas aeruginosa Migula ATCC 27853）、熱 死 環(huán) 絲 菌（Brochothrix thermosphacta ATCC 11509），西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保藏；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/mg）、木瓜蛋白酶（4 500 U/mg），美國(guó)Sigma 公司；殼聚糖（脫乙酰度≥90%，食用級(jí)）、茶多酚（含量≥60%，食品級(jí)）、普魯蘭多糖、蘋(píng)果多酚、納他霉素、ε-聚賴(lài)氨酸等，鄭州博研生物科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

PK121R 型低溫冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；PB-10 pH 計(jì)，德國(guó)Sartorius 公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；ES315 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；PYX-DHS-40×50-BSII 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)；BCD-450ZE9H 型冰箱，合肥美菱股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳源抗菌肽的制備試驗(yàn) 用新鮮牛乳和羊乳等電點(diǎn)沉淀酪蛋白。稱(chēng)取適量牛、羊酪蛋白于6個(gè)三角瓶中溶解，調(diào)節(jié)pH 值至蛋白酶酶活最適條件下，單獨(dú)加入木瓜蛋白酶酶解1.5 h，單獨(dú)加入胃蛋白酶酶解2 h；復(fù)合蛋白酶解是先加入木瓜蛋白酶酶解1.5 h，再加入胃蛋白酶酶解2 h，合計(jì)酶解3.5 h[15-16]。水解過(guò)程持續(xù)使用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 值，使之始終保持在所需值。水解完成后95 ℃滅酶5 min，冷卻離心后測(cè)定上清液的抑菌活性，確定乳源抗菌肽的制備方法。

1.2.2 生物保鮮劑對(duì)冷卻肉主要腐敗菌的抑制作用 將蘋(píng)果多酚、茶多酚、乳酸鏈球菌素、普魯蘭多糖溶于無(wú)菌蒸餾水中，殼聚糖溶于1%的乙酸溶液中，配制不同濃度梯度，見(jiàn)表3。將所有保鮮劑pH 值調(diào)節(jié)至5.0 ± 0.2。

分別選用不同濃度的殼聚糖、蘋(píng)果多酚、茶多酚、乳酸鏈球菌素和普魯蘭多糖，研究其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、腸球菌、假單胞菌和熱死環(huán)絲菌等冷卻肉主要腐敗菌的抑制效果。將活化的各菌種制成107CFU/mL 的菌懸液，吸取100 μL 涂布于凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，待菌液吸收后打孔加樣液，在適宜溫度下培養(yǎng)16～24 h，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

1.2.3 復(fù)配保鮮劑對(duì)冷卻肉保鮮效果的影響

1.2.3.1 肉樣處理 將當(dāng)天超市銷(xiāo)售的冷鮮原料肉（豬、羊后腿肉）在無(wú)菌室進(jìn)行剔骨、去筋、去脂肪，分割成10 g 的小肉塊，隨機(jī)分成6 組，每組30塊，然后將樣品于對(duì)應(yīng)的兩種復(fù)配保鮮劑中浸泡3 min，取出瀝干，放入干凈的PE 保鮮袋中，貼上標(biāo)簽，放于2～4 ℃冰箱中貯存，分別在第1，4，7，10，13，16 天進(jìn)行新鮮度指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3.2 新鮮度指標(biāo)測(cè)定

1） 感官評(píng)價(jià) 采用感官評(píng)分法，根據(jù)GB/T 22210-2008 《肉與肉制品感官評(píng)價(jià)規(guī)范》[17]，由5名有感官評(píng)分經(jīng)驗(yàn)的人員組成感官評(píng)價(jià)小組，分別對(duì)色澤、氣味、組織狀態(tài)等感官指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定，每項(xiàng)指標(biāo)評(píng)定結(jié)果均采用5 分法表示，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1，綜合得分取各項(xiàng)得分的平均值。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The sensory evaluation standards

2） pH 值的測(cè)定 按GB5009.237-2016 《食品pH 值的測(cè)定》方法測(cè)定[18]。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：一級(jí)鮮度≤6.2，二級(jí)鮮度6.2-6.7，變質(zhì)肉＞6.7。

3） 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N 值）的測(cè)定 據(jù)揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定原理，按GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》進(jìn)行[19]。按國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定一級(jí)鮮肉≤15 mg/100 g，二級(jí)鮮肉≤25 mg/100 g，變質(zhì)肉＞25 mg/100 g。

4） 菌落總數(shù)的測(cè)定 按照GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)》測(cè)定[20]。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：一級(jí)鮮度≤104CFU/g，二級(jí)鮮度≤106CFU/g，變質(zhì)肉＞106CFU/g。

5） 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS 值）的測(cè)定測(cè)定方法參照GB 5009.181-2016《食品中丙二醛的測(cè)定》方法進(jìn)行[21]。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：一級(jí)鮮度≤0.3 mg/mL，二級(jí)鮮度≤0.7 mg/mL，變質(zhì)肉＞0.7 mg/mL。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用DPS 9.50 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理，每個(gè)處理做3 個(gè)重復(fù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源的酶解液抗菌作用比較

不同蛋白酶水解牛、羊乳酪蛋白獲得的乳源抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌效果見(jiàn)表2。

表2 牛乳和山羊乳酪蛋白酶解液對(duì)大腸桿菌的抑制作用Table 2 The inhibitory effect of casein enzymatic hydrolysate from milk and goat on Escherichia coli

由表2可知，出現(xiàn)最大平均抑菌圈的是山羊乳的胃蛋白酶酶解液，達(dá)12.7 mm，其抑菌效果比其它試驗(yàn)組高，差異顯著（P＜0.05），且兩酶復(fù)合后酶解液的抑菌效果不及單種酶酶解液的抑菌效果強(qiáng)。雖然牛、羊乳的胃蛋白酶解液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05），但山羊乳的胃蛋白酶酶解液的抑菌圈直徑較大。采用山羊乳胃蛋白酶酶解液做保鮮試驗(yàn)，測(cè)得山羊乳抗菌肽的活性肽質(zhì)量濃度為14.25g/L。

2.2 生物保鮮劑對(duì)冷卻肉主要腐敗菌的抑制作用

2.2.1 單因素生物保鮮劑的抑菌試驗(yàn) 由表3可知，殼聚糖和抗菌肽對(duì)所測(cè)試菌種有良好的抑制作用。普魯蘭多糖本身并無(wú)抑菌性，而它形成的氣密性良好的膜，可以抑制肉的呼吸強(qiáng)度，減少水分散失，因此常用于食品的防腐保鮮。乳酸鏈球菌素（Nisin）總體抑菌效果不佳，抑菌圈不明顯，表現(xiàn)為抑菌譜較窄，在以下試驗(yàn)中選擇放棄使用Nisin。蘋(píng)果多酚、茶多酚的高濃度抑菌效果優(yōu)于低濃度組。相反ε-聚賴(lài)氨酸的低濃度組效果優(yōu)于高濃度組，可能由于ε-聚賴(lài)氨酸與蛋白相互作用，導(dǎo)致其抗菌活力的減弱或喪失[22]。

殼聚糖和普魯蘭多糖都可作為可食性抗菌保鮮膜，已應(yīng)用在肉蛋及水果的防腐保鮮過(guò)程中[23-25]。蘋(píng)果多酚和茶多酚均為天然酚類(lèi)抗氧化劑，自然界含量豐富[26-27]。有研究表明蘋(píng)果多酚與殼聚糖復(fù)合使用時(shí)抑菌效果會(huì)更明顯[28-29]。納他霉素與殼聚糖等防腐保鮮劑聯(lián)合使用可以得到更好的保鮮效果[30-31]。根據(jù)單因素試驗(yàn)抑菌結(jié)果及各保鮮劑的功能特性復(fù)配兩組保鮮劑，選擇復(fù)配以下兩種保鮮劑。1#復(fù)配保鮮劑是由抗菌肽、納他霉素、蘋(píng)果多酚和殼聚糖復(fù)合而成，2#復(fù)配保鮮劑是由抗菌肽、ε-聚賴(lài)氨酸、茶多酚、普魯蘭多糖復(fù)合而成。

2.2.2 復(fù)配生物保鮮劑的抑菌試驗(yàn) 結(jié)合表4、表5，以主要腐敗菌抑菌直徑及其平均直徑為指標(biāo)，采用軟件DPS 9.50 處理數(shù)據(jù)可得抑菌效果較好的兩種保鮮劑的4 種濃度配制方法。1#復(fù)配保鮮劑的較優(yōu)的處理是N1和N2，配方是抗菌肽、納他霉素、蘋(píng)果多酚、殼聚糖，其質(zhì)量濃度分別為14.25，2.50，4.00，2.28 g/L 和7.50，1.38，3.10，0.50 g/L；2#復(fù)配保鮮劑的較優(yōu)的處理是N3和N4，配方是抗菌肽、ε-聚賴(lài)氨酸、茶多酚、普魯蘭多糖，其質(zhì)量濃度分別為6.53，0.19，1.90，2.00 g/L 和6.55，1.00，2.50，2.00 g/L。

由表6可知，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，出現(xiàn)較大平均抑菌直徑的保鮮劑分別是復(fù)配保鮮劑N1和N4，即15.21 cm 和11.20 cm，且N1和N2、N3和N4間差異顯著（P＜0.05）。雖然N1、N4復(fù)合保鮮劑的用量稍大，但抑菌保鮮作用更明顯。綜上考慮可將復(fù)配保鮮劑定為以下兩種：1#保鮮劑是抗菌肽（14.25 g/L）、納他霉素（2.50 g/L）、蘋(píng)果多酚（4.00 g/L）、殼聚糖（2.28 g/L），2#保鮮劑是抗菌肽（6.55 g/L）、ε-聚賴(lài)氨酸（1.00 g/L）、茶多酚（2.50 g/L）、普魯蘭多糖（2.00 g/L）。

表3 5 種天然保鮮劑及抗菌肽對(duì)冷卻肉主要腐敗菌的抑制作用Table 3 Antibacterial effect of five kinds of natural preservatives and antimicrobial peptides on the main spoilage bacteria of chilled meat

表4 1#復(fù)配保鮮劑的配制及其對(duì)冷卻肉主要腐敗菌的抑制作用Table 4 Preparation of compound preservative 1# and its inhibitory effect on the main spoilage bacteria of chilled meat

表5 2#復(fù)配保鮮劑的配制及其對(duì)冷卻肉主要腐敗菌的抑制作用Table 5 Preparation of compound preservative 2# and its inhibitory effect on the main spoilage bacteria of chilled meat

（續(xù)表5）

表6 兩種不同濃度的復(fù)配保鮮劑對(duì)冷卻肉主要腐敗菌抑制作用的驗(yàn)證試驗(yàn)Table 6 Validation test of the various concentrations of two kinds of compound preservative and their inhibitory effects on the main spoilage bacteria of chilled meat

2.3 復(fù)配生物保鮮劑對(duì)原料肉保鮮效果的影響

2.3.1 冷卻肉感官評(píng)分變化 感官評(píng)分是評(píng)價(jià)原料肉腐敗變質(zhì)的指標(biāo)之一[35]，評(píng)分低于2.5 分時(shí)樣品已不可接受。原料肉在整個(gè)冷藏過(guò)程中感官評(píng)分呈下降趨勢(shì) （圖1），1#保鮮劑組感官分值下降速度明顯比空白組慢。使用保鮮劑的豬肉在第13天時(shí)降到2.5 分。羊肉空白組在第13 天時(shí)接近3分，而羊肉2#保鮮劑組在第13 天低于2.5 分。這是由于在實(shí)際操作中使用含茶多酚的2#保鮮劑組在色澤和黏度方面得分明顯低于空白組，使得原料肉看起來(lái)色澤暗淡，有不新鮮感。從感官指標(biāo)考慮，1#保鮮劑能有效提高原料肉的感官可接受度，而2#保鮮劑推廣價(jià)值較低。

圖1 原料肉冷藏過(guò)程中感官評(píng)分的變化Fig.1 Changes of sensory scores of raw meat during cold storage

2.3.2 pH 值變化 宰后肌肉達(dá)到極限pH 值后，在自身蛋白酶和外源微生物的分解作用下，蛋白質(zhì)被分解為氨或胺類(lèi)化合物等堿性物質(zhì)，使pH值逐漸升高[32]。由于很多因素如采樣部位不同或宰前豬的生理狀況等均影響pH 值的變化，因此它只能作為檢驗(yàn)原料肉新鮮度的參考指標(biāo)[33]。由圖2可知，原料肉在冷藏過(guò)程中，其pH 值均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。第9 天時(shí)豬肉空白組pH值接近6.6 成為變質(zhì)肉，而使用保鮮劑的試驗(yàn)組均在第12 天后pH 值在6.2 以上，成為次新鮮肉，第15 天才開(kāi)始變質(zhì)；第11 天羊肉空白組pH 值超過(guò)6.5，開(kāi)始腐敗變質(zhì)。1#、2#保鮮劑組在16 d 后pH 值達(dá)6.6，屬于腐敗變質(zhì)肉。按pH 值來(lái)評(píng)價(jià)，使用1#保鮮劑試驗(yàn)組的保鮮期在13～15 d，與空白組相比，可延長(zhǎng)保鮮期3～6 d；使用2#保鮮劑試驗(yàn)組的保鮮期在12～14 d，與空白組相比，可延長(zhǎng)保鮮期2～5 d。

圖2 原料肉冷藏過(guò)程中pH 值的變化Fig.2 Changes of pH value of raw meat during cold storage

2.3.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值的變化 TVB-N是評(píng)價(jià)肉類(lèi)腐敗的常用指標(biāo)。TVB-N 值越高，肉的腐敗程度越高。由圖3可以看出各組的TVB-N值均隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，其中兩空白組上升速率較快，5 d 左右，其TVB-N 值超過(guò)15 mg/100 g，成為次新鮮肉。使用保鮮劑組在整個(gè)冷藏過(guò)程中TVB-N 值均小于空白組。豬肉、羊肉保鮮1 試驗(yàn)組在冷藏7 d 和13 d 的TVB-N 值是13.48，14.16 mg/100 g 和21.74，22.09 mg/100 g，到16 d 時(shí)超出鮮肉范圍（25 mg/100 g），成為變質(zhì)肉。2#保鮮劑試驗(yàn)組與1#保鮮劑相比，差異顯著（P＜0.05）。按TVB-N 值來(lái)評(píng)價(jià)，使用保鮮劑對(duì)原料肉的保鮮有較好的效果，且使用1#保鮮劑效果更佳。與空白組相比，可延長(zhǎng)冷卻肉冷藏期保鮮期3～5 d。

圖3 原料肉冷藏過(guò)程中TVB-N 值的變化Fig.3 Changes of TVB-N value of raw meat during cold storage

2.3.4 菌落總數(shù)的變化 從圖4可看出，隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組菌落總數(shù)不斷增加。空白組的菌落總數(shù)從保藏開(kāi)始就迅速增加，豬、羊肉空白組分別在冷藏第6、7 天達(dá)到4.07 lg（CFU/g），成為次新鮮肉。經(jīng)保鮮劑處理，原料肉中微生物的生長(zhǎng)繁殖受到不同程度的抑制。1#保鮮劑試驗(yàn)組在前9 d 菌落總數(shù)增加較2#保鮮劑試驗(yàn)組緩慢，之后因冷卻肉進(jìn)入次新鮮階段，菌落總數(shù)增長(zhǎng)速度均明顯加快。使用保鮮劑的原料肉基本在第9 天進(jìn)入次新鮮肉階段，第12 天進(jìn)入腐敗變質(zhì)階段，兩保鮮劑組差異顯著（P＜0.05）。按菌落總數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)，使用兩種保鮮劑均能有效抑制原料肉中主要腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，與空白組相比，可延長(zhǎng)保鮮期3～4 d。

圖4 原料肉冷藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化Fig.4 Changes of the total plate count of raw meat during cold storage

2.3.5 硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（TBARS）值的變化肉類(lèi)食品中脂質(zhì)的氧化通常采用2-硫代巴比妥酸值法（即TBA 值法）進(jìn)行評(píng)價(jià)。TBARS 值的高低反映脂肪氧化程度的大小。隨著冷藏過(guò)程中氧化程度的加深，次級(jí)產(chǎn)物不斷增多，因而用TBARS 值表示試驗(yàn)結(jié)果[34]。從圖5可以看出，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組TBARS 值呈上升趨勢(shì)。在第9 天時(shí)羊肉空白組的TBARS 值超過(guò)0.3 mg/kg，成為次新鮮肉，其余5 組均在新鮮肉的范圍；第13 天時(shí)，兩空白組的TBARS 值超過(guò)0.7 mg/kg，進(jìn)入變質(zhì)肉階段，而涂有第2 種保鮮劑的原料肉還在次新鮮肉階段，且1#保鮮劑試驗(yàn)組與2#保鮮劑試驗(yàn)組效果差異不顯著（P＞0.05）。按TBARS 值來(lái)評(píng)價(jià)，兩種保鮮劑均對(duì)原料肉脂肪的氧化有明顯的抑制作用，與空白組相比，均可延長(zhǎng)保鮮期4～6 d。

圖5 原料肉冷藏過(guò)程中TBARS 值隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes of TBARS value of raw meat during cold storage

3 結(jié)論

結(jié)合山羊乳抗菌肽與天然保鮮劑的自身特性和抑菌效果復(fù)配兩種保鮮劑，1#保鮮劑是抗菌肽（14.25g/L）、納他霉素（2.50 g/L）、蘋(píng)果多酚（4.00 g/L）、殼聚糖（2.28 g/L），2#保鮮劑是抗菌肽（6.55g/L）、ε-聚賴(lài)氨酸（1.00 g/L）、茶多酚（2.50 g/L）、普魯蘭多糖（2.00 g/L）。1#和2#保鮮劑均有延長(zhǎng)冷卻豬肉和羊肉保鮮期的作用。由于2#保鮮劑試驗(yàn)組中原料肉感官方面接受度不高，所以使2#保鮮劑可推廣價(jià)值性低而被放棄使用?？傮w來(lái)看，1#保鮮劑能夠有效控制TVB-N 值和TBARS 值，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，提高感官評(píng)定分值。其制作工藝簡(jiǎn)單，安全方便，是一種推廣價(jià)值很高的原料肉保鮮方法。