葛根紅曲提取物對高脂飼料誘導肥胖小鼠的抗肥胖功效

何冬萍 朱曉萍 陳麗玲 劉志彬 倪 莉

（福州大學食品科學技術研究所 福建省食品生物技術創(chuàng)新工程技術研究中心 福州350108）

紅曲霉（Monascus spp.）在生長過程會產(chǎn)生紅曲色素、Monacolin 類物質等次級代謝產(chǎn)物。其中，紅曲色素可作為天然食品色素應用于食品工業(yè)，而且還具有抗氧化、抗炎癥、抗肥胖、調節(jié)膽固醇等作用[1]；而Monacolin K 是公認的具有降低膽固醇、血脂調節(jié)作用的藥物[2]。紅曲霉一般以糯米為基質進行發(fā)酵，最終產(chǎn)品稱為紅曲米，可用于黃酒釀造、食品發(fā)酵、紅曲色素生產(chǎn)。除糯米外，也有研究者使用山藥[3]、黑豆[4]等成分作為基質進行紅曲霉發(fā)酵，獲得功能性更佳的紅曲色素產(chǎn)品。

葛根（Radix puerariae）是豆科植物，含有豐富的淀粉、黃酮等成分，具有良好的保健功能。其含有的黃酮類物質——葛根素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡，擴張血管，保護神經(jīng)細胞與心肌細胞等藥理活性[5]。以葛根替代傳統(tǒng)糯米作為紅曲霉發(fā)酵基質，可以為紅曲霉的生長提供必要的碳源、氮源等營養(yǎng)素，同時葛根中的黃酮還具有調節(jié)紅曲霉次級代謝產(chǎn)物的作用。此外，黃酮的引入有可能使紅曲產(chǎn)品具有更好得保健功效。

本課題組前期以葛根作為基質，液態(tài)發(fā)酵紅曲霉生產(chǎn)紅曲色素，結果發(fā)現(xiàn)紅曲色素產(chǎn)量得到顯著提高，并能有效降低桔霉素含量，發(fā)酵產(chǎn)物還含有一定的黃酮含量，可能具有一定的抗肥胖、調節(jié)血脂等功效[6]。本研究通過小鼠動物實驗評估該葛根紅曲發(fā)酵產(chǎn)物的抗肥胖功效。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

1.1.1 動 物 40 只SPF 級4 周 齡C57BL/6J 小鼠，由上海斯萊克公司提供。

1.1.2 主要試劑 小鼠脂多糖結合蛋白（LBP）酶聯(lián)免疫試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；Monaclin K，當?shù)厮幍辏粯藴曙暳螹D12062[16%脂肪，4.00 kcal/（g·m）]和高脂飼料MD12032[45%脂肪，4.73 kcal/（g·m）]，江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。

1.2 儀器設備

TE601-L 電子天平，德國賽多利斯公司；AU2700 全自動生化分析儀，奧林巴斯（中國）有限公司；YXOSG41280 型高壓蒸汽滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；CF16RXⅡ高速冷凍離心機，日立中國有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海申騰科技有限公司；ULT1386-5-V41 型-80 °C 超低溫冰箱，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPE 的制備 將發(fā)酵得到的葛根紅曲發(fā)酵液于4 500 r/min 條件下離心10 min，得到菌體，用去離子水洗滌3 次，加入70%乙醇溶液、混勻，超聲20 min，于60 ℃條件下提取2 h，重復提取1次，4 500 r/min 條件下離心10 min，得到MRPE。將MRPE 凍干，過100 目篩得到MRPE 粉末，備用。

1.3.2 MRPE 成分測定 采用UV 法測定MRPE中色素含量[7]。將MRPE 粉末溶于70%乙醇溶液，稀釋一定倍數(shù)后分別于410，465，510 nm 處測定吸光值，黃色價=OD410nm×稀釋倍數(shù)，橙色價=OD465nm×稀釋倍數(shù)，紅色價= OD510nm×稀釋倍數(shù)，總色價= 黃色價+橙色價+紅色價，單位U/g。采用UV 法測定MRPE 中總黃酮含量，具體操作參考文獻[8]。采用HPLC 測定MRPE 中的桔霉素含量，具體方法參考國家標準《紅曲產(chǎn)品中桔青霉素的測定》GB/T 5009.222-2008[9]。采用HPLC 測定MRPE中Monacolin K 含量，具體操作參考文獻[10]。

1.3.3 動物分組處理 實驗動物飼養(yǎng)于福建省福建醫(yī)科大學實驗動物中心。將40 只小鼠飼養(yǎng)于同一間SPF 級屏障動物實驗室的IVC 系統(tǒng)中，小鼠平均體重約為17.00 g/只。隨機選取8 只小鼠喂食正常飼料（C 組），其余32 只小鼠用高脂飼料喂食誘導其形成肥胖，然后隨機分成4 組，繼續(xù)喂食高脂飼料并分別灌胃無菌水 （HF 組，n=8），Monacolin K（MK 組，n=8），正常劑量MRPE（MRPE-C組，n=8），高劑量MRPE（MRPE-H 組，n=8），為期4 周。紅曲霉產(chǎn)品的每日推薦攝入量為1.0～2.0 g/成年人[11-12]，按體重換算為30 mg/kg，作為小鼠的正常灌胃劑量；以5 倍正常劑量（150 mg/kg）作為高劑量的灌胃劑量。Monacolin K 灌胃劑量約為300 μg/kg。飼養(yǎng)期間，飼養(yǎng)房間內明、暗交替條件為12 h/12 h 的光照循環(huán)，每天于晚上7 點關閉日光燈，早上7 點開日光燈。水量和飼料量充足，且小鼠飲水和攝食均自由。每天記錄飲水量和攝食量，每周記錄小鼠體重。

1.3.4 小鼠解剖與取樣 小鼠飼養(yǎng)周期結束后，給小鼠禁食12h 后，稱重后，取眼眶血，用肝素抗凝管收集血液。將小鼠拉直，用直尺量小鼠體長，即鼻尖到肛門的長度，并做好記錄。剪開小鼠腹部皮膚，取下附睪脂肪、腸系膜脂肪、腹膜后脂肪，分別稱重并記錄。

1.3.5 Lee’s 指數(shù) 根據(jù)小鼠的體重與體長，計算Lee’s 指數(shù)。其計算公式為：Lee’s 指數(shù)=[體重（g）×1 000]∧（1/3）/體長（cm）。

1.3.6 血清生化分析 采血當日，取200 μL 小鼠血清于Olympus AU2700 全自動生化分析儀中測定血清中的總膽固醇含量 （TC）、甘油三酯含量（TG）、高密度脂蛋白膽固醇含量（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇含量（LDL-C）。

1.3.7 血清脂多糖含量測定 按照脂多糖（LBP）測定試劑盒操作說明書測定血清中脂多糖含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 使用 IBM SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件的Duncan 檢驗（P＜0.05）對試驗數(shù)據(jù)進行樣本間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 MRPE 成分分析

紅曲色素是紅曲霉代謝過程中產(chǎn)生的一系列聚酮化合物的混合物，屬于復合色素。根據(jù)最大吸收波長的分布可分為三大類：紅色素、橙色素和黃色素?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)100 多種紅曲色素組分[13]，其中確定結構的僅有6 種醇溶性色素，即：具有橙色調的紅曲玉紅素 （Monascorubrine） 和紅斑紅曲素（Rubropunctatine）；黃色調的安卡紅曲黃素（Ankaflavine）和紅曲素（Monascine）；紅色調的紅斑玉紅胺（Monascorubramine） 和紅斑紅曲胺（Rubropunctamine）[14]。從表1可以看到，MRPE 中總色價為（6 500.00 ± 181.87） U/g，遠高于普通米粉發(fā)酵的紅曲色素產(chǎn)量（50～2 500 U/g）。其中黃色素含量最高，其次是紅色素，含量最少的是橙色素。MRPE 中Monacolin K 含量較少，（0.11±0.03）mg/g，遠低于作為對照的市售Monacolin K 產(chǎn)品（980 mg/g）。本研究中使用的紅曲霉FZU-MP1501（CGMCC No.12516）屬于高產(chǎn)色素菌株，所代謝的Monacolin K 含量較少[6]。此外，桔霉素也是紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物之一，屬于真菌毒素，其安全性受到質疑，也使得紅曲產(chǎn)品的應用受到限制。據(jù)日本厚生省對于紅曲產(chǎn)品中桔霉素的限量指標為每500 U 色素中桔霉素含量不超過0.2 μg[15]。本研究使用的MRPE 中桔霉素含量符合該標準。此外，MRPE 中的總黃酮含量為0.43%，表明葛根的添加使得MRPE 中有效活性成分更加豐富。

表1 樣品的成分Table 1 The composition of the sample

2.2 小鼠的體重、體脂肪含量和Lee’s 指數(shù)

經(jīng)13 周高脂飼料喂養(yǎng)，小鼠體重比正常飼料喂養(yǎng)小鼠高20%，誘導形成肥胖小鼠。對肥胖小鼠繼續(xù)喂食高脂飼料并分別灌胃蒸餾水、MK、正常劑量MRPE 和高劑量MRPE，為期4 周，期間其體重變化如圖1所示。灌胃4 周后，MK 組和樣品組小鼠體重均顯著低于HF 組 （P＜0.01），MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組分別比HF 組小鼠的體重降低了9.80%，10.90%和13.00%。MRPE 兩種劑量之間沒有顯著性差異 （P＞0.05）。結果表明MRPE 對肥胖小鼠的減重效果不遜于MK，利用葛根紅曲提取物對肥胖小鼠有顯著的體重控制效果。

圖1 小鼠的體重變化Fig.1 Variation of body weight of mice

MRPE 及MK 處理4 周后，取小鼠的腹部附睪脂肪、腸系膜脂肪和腹膜后脂肪分別稱重，并計算三者的總和及其與對應小鼠體重的比值，結果見圖2。小鼠腹部解剖圖見圖3。從圖2可以看出，3 個部位中附睪脂肪所占比例最大。HF 組肥胖小鼠體內脂肪堆積最為嚴重，附睪、腸系膜脂肪和腹膜后脂肪均為最高，總脂體比為（71.23±10.38）mg/g，比C 組高了1.84 倍。MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組小鼠總脂體比顯著低于HF 組，分別降低39.00%，19.10%和35.60%。與Monacolin K相比，MRPE-C 改善小鼠體內脂肪堆積的效果較弱（P＜0.05），而MRPE-H 組與MK 組沒有顯著性差 異 （P＞0.05）。MRPE-H 組小鼠總體脂比比MRPE-C 低20.43%，說明在減脂程度上MRPE 具有劑量依賴性。

Lee’s 指數(shù)為肥胖指標，綜合考慮了小鼠的體重與體長，是目前評價肥胖程度方面的有效指數(shù)。一般來說，Lee’s 指數(shù)越大，肥胖越明顯。從圖4的Lee’s 指數(shù)可看出，灌胃4 周后，HF 組Lee’s指數(shù)最大，這與前面的結果趨勢一致。綜合以上結果可知，葛根紅曲提取物可以防止小鼠體內脂肪堆積，對小鼠體重有顯著的控制效果，在一定程度上具有劑量依賴性。

圖2 各組小鼠各部位脂肪質量Fig.2 Weight of different adipose tissues

圖3 小鼠腹部脂肪解剖圖Fig.3 Anatomical pictures of abdominal adipose

2.3 肥胖小鼠血脂水平變化

從圖5可以看出，小鼠經(jīng)4 周不同藥物灌胃后，MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組小鼠的血清TC 水平均與HF 組有顯著性差異（P<0.05），分別比HF 組低16.22%，10.46%和13.35%；各組小鼠血清TG 水平變化趨勢與TC 水平一致，MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組的血清TG 含量分別比HF 組低22.34%，28.13%和31.15%；MK 組、MRPEC 組和MRPE-H 組小鼠的血清HDL-C 水平均顯著高于HF 組（P<0.05），分別提高了9.74%，8.83%和7.33%；血清LDL-C 水平中僅MK 和MRPE-H組與HF 組具有顯著性差異（P<0.05），二者分別比HF 組降低了21.23%和14.88%，且MRPE-H 組的血清LDL-C 水平比MRPE-C 組低了8.22%，在一定程度上MRPE 呈現(xiàn)出劑量依賴效果?？偟膩碚f，葛根紅曲提取物對肥胖小鼠血脂水平有顯著的改善作用，與Monacolin K 效果相當。

圖4 各組小鼠的Lee’s 指數(shù)Fig.4 Lee’s index of each mice group

圖5 各組小鼠的血脂水平Fig.5 Plasma lipids of mices

2.4 血清LBP 水平

脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分。當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后會釋放出脂多糖（LPS），導致機體炎癥反應。而內毒素結合蛋白（LBP）是機體受到內毒素刺激時由肝臟合成的急性炎癥反應蛋白，其含量多少可反應血液中內毒素的含量[16]。本試驗將各組小鼠血液，按照試劑盒說明書測定血清中的LBP 濃度，結果見圖6。MK 組、MRPE-C 組和MRPE-H 組的小鼠血清LBP 濃度均與HF 組有顯著性差異 （P<0.05），分別比HF 組降低了40.44%，54.96%和50.46%，表明葛根紅曲提取物在一定程度上降低血清LBP 能力強，具有一定的抗炎癥能力。

圖6 小鼠脂多糖結合蛋白（LBP）濃度Fig.6 Plasma LBP concentration of mice

3 討論

本研究動物試驗結果表明：MRPE 能夠顯著降低肥胖小鼠的體重、脂肪含量，以及血清TC、TG水平和LBP 含量，且顯著提高血清HDL-C 水平，說明利用葛根作為基質得到的紅曲發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的抗肥胖功效。從成分分析結果看，由于菌株特性和發(fā)酵方式等的不同，MRPE 中成分主要以紅曲色素為主，且MRPE 中成分較普通紅曲米更為豐富，含有黃酮類物質。Jeun J 等[17]研究中，同樣選用C57BL/6 肥胖小鼠進行有關紅曲色素抗肥胖試驗，該研究以100 mg/kg 飼料劑量的紅曲橙色素作為肥胖干預物質來飼喂小鼠，劑量介于本研究正常劑量和高劑量之間，其結果表明橙色素顯著降低了小鼠TC 水平 （實驗組低于對照組約16%）、血清LDL-C 水平 （實驗組低于對照組約26%）并提高血清HDL-C 水平（實驗組高于對照組約9%）?？梢?，MRPE 能達到與純化的紅曲色素相當?shù)慕笛Ч?，其中的黃酮組分可能發(fā)揮了一定作用。有趣的是，Chen 等[18]發(fā)現(xiàn)紅曲米水溶性提取物（RMR-W）和醇溶性提取物（RMR-E）都能抑制3T3-L1 前脂肪細胞分化，其中RMR-W 還能提高成熟3T3-L1 脂肪細胞的脂肪分解活性，而RMR-E 和洛伐他汀卻沒有顯著影響?？梢?，紅曲色素的抗肥胖作用可能并非通過直接調節(jié)脂肪細胞實現(xiàn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，MRPE 具有降低血清LBP 的作用。肥胖會伴隨輕度炎癥，具有較高的血清LBP水平[19]。LBP 是來源于革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖，目前有大量文獻報道了腸道菌群的失衡有可能是導致血清LBP 提高的原因，進而引發(fā)炎癥，加速肥胖的形成[20]。MRPE 的抗肥胖、降低血清LBP 的作用有可能是通過調節(jié)腸道菌群實現(xiàn)。后續(xù)需要進一步研究證實MRPE 的腸道菌群調節(jié)功能及其它可能的抗肥胖機制。