氨基糖苷類(lèi)抗生素的拓展應(yīng)用研究進(jìn)展

盧明 陳代杰

(1 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203；2 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

氨基糖苷類(lèi)抗生素是較早被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的一類(lèi)抗生素。自1944年Waksman從灰色鏈霉菌中分離得到鏈霉素，大量氨基糖苷類(lèi)抗生素相繼被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于細(xì)菌性感染的臨床治療[1]。鏈霉素發(fā)現(xiàn)近20年后，研究表明氨基糖苷類(lèi)抗生素能夠抑制提前終止密碼子PTC(premature termination codon)的閱讀并恢復(fù)大腸埃希菌中的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)產(chǎn)生[2]。在人體中5%～70%的遺傳疾病是由框內(nèi)無(wú)義突變引起的，其在致病基因內(nèi)引入提前終止密碼子(PTC)。因此，在翻譯過(guò)程中形成了具有病理學(xué)意義的無(wú)功能或功能缺陷的截短蛋白。PTC抑制可以描述為一種以基因和疾病非依賴(lài)性方式治療突變的治療策略，該方法旨在抑制蛋白質(zhì)合成過(guò)程中核糖體的保真度，以便可以將共享PTC 3個(gè)核苷酸中2個(gè)核苷酸的近同源氨基tRNA插入肽鏈，從而繼續(xù)翻譯，并完整翻譯等長(zhǎng)度的功能蛋白[3]。因此，對(duì)許多遺傳性疾病的治療，抑制PTCs是一種可行的策略。

隨著RNA催化潛力的發(fā)現(xiàn)，許多氨基糖苷被報(bào)道與各種RNA分子相互作用并干擾其功能。其中除了原核蛋白翻譯抑制位點(diǎn)16S rRNA，還包括第一組內(nèi)含子自我剪接酶、RNase P和錘頭狀核酶[4]。此外，這些抗生素還通過(guò)干擾必要的RNA蛋白接觸抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制[5-6]。在過(guò)去的幾年里，關(guān)于RNA結(jié)構(gòu)和功能的信息迅速增加，對(duì)RNA結(jié)合抗生素的作用模式有了更詳細(xì)的了解。本文將從氨基糖苷類(lèi)抗生素作用機(jī)制及應(yīng)用兩方面綜述其拓展研究進(jìn)展。

1 氨基糖苷類(lèi)抗生素作用機(jī)制

1.1 氨基糖苷類(lèi)抗生素抑制PTCs的作用機(jī)制

氨基糖苷類(lèi)抗生素是一類(lèi)由單個(gè)或多個(gè)糖基取代的氨基環(huán)醇類(lèi)化合物。其殺菌作用是通過(guò)與原核生物30S核糖體16S rRNA的A1408部位結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)譯，從而促使細(xì)菌細(xì)胞的死亡[7]。在真核生物的翻譯過(guò)程中(圖1)，同源氨基酰基-tRNA(完全匹配的堿基對(duì))和近同源氨基?；?tRNA(包含3個(gè)堿基對(duì)中的2個(gè))都可以與A位點(diǎn)相互作用。同源氨基?；? tRNA進(jìn)入A位點(diǎn)后，氨基酸添加到多肽鏈上后易位到P位點(diǎn)，空出A位點(diǎn)，從而允許下一個(gè)密碼子信使RNA序列的堿基配對(duì)和翻譯[8]。當(dāng)一個(gè)核糖體遇到一個(gè)終止密碼子的信使RNA序列，沒(méi)有同源氨基酰基-tRNA可以與A位點(diǎn)序列堿基配對(duì)。此時(shí)，真核釋放因子eRF1和eRF3通過(guò)二者之間的相互作用促進(jìn)肽- trna的水解，并通過(guò)形成“終止復(fù)合物”來(lái)釋放新形成的多肽。eRF1識(shí)別并結(jié)合A位點(diǎn)的終止密碼子，改變了核糖體肽轉(zhuǎn)移酶的活性。eRF3以依賴(lài)于GTP的方式通過(guò)eRF1刺激肽的釋放[9-10]。

近同源的氨基?；?tRNA能夠與eRFs競(jìng)爭(zhēng)A位點(diǎn)上的終止密碼子的結(jié)合[11]。這導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸被整合到延長(zhǎng)的多肽鏈中，并將這種tRNA-肽鏈復(fù)合物轉(zhuǎn)移到P位點(diǎn)，有效地允許終止密碼子的“通讀”。每個(gè)終止密碼子都可以通過(guò)使用一組特定的近同源氨基酸進(jìn)行無(wú)義抑制來(lái)翻譯(圖1)。正常情況下，人體內(nèi)PTCs的通讀概率＜1%，自然終止密碼子的抑制概率＜0.1%[12]。無(wú)義突變的基礎(chǔ)水平過(guò)低，無(wú)法恢復(fù)功能，但功能蛋白的進(jìn)一步增加可能緩解疾病[13]。多種氨基糖苷類(lèi)藥物在體內(nèi)外及多種組織和疾病模型中均已表現(xiàn)出無(wú)義抑制活性，包括慶大霉素、帕洛霉素、G418、鏈霉素、利維霉素、妥布霉素等，通過(guò)增加PTCs通讀恢復(fù)少量的功能活性蛋白，在緩解多種遺傳疾病方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[14-17]。在氨基糖苷介導(dǎo)的無(wú)義抑制過(guò)程中，通讀效率與誘導(dǎo)A位點(diǎn)結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系尚不完全清楚。目前上述氨基糖苷類(lèi)抗生素中，G418、慶大霉素和帕洛霉素具有最廣泛和最有效的PTC通讀活性[19-21]。PTCs通讀效能不僅因基因而異，還取決于相關(guān)基因中終止密碼子的類(lèi)型和位置以及周?chē)膍RNA序列。一些終止密碼子比其他密碼子更容易被通讀，盡管有一項(xiàng)研究表明終止密碼子的類(lèi)型和慶大霉素治療效果之間沒(méi)有相關(guān)性，但對(duì)于UGA＞UAG＞UAA的偏愛(ài)確已被報(bào)道[11,22]。

1.2 氨基糖苷類(lèi)抗生素抑制RNA酶作用機(jī)制

氨基糖苷類(lèi)抗生素由氨基糖與氨基環(huán)醇通過(guò)氧橋連接而成，是具有高度柔韌性的多電荷化合物。RNA鏈上的負(fù)電荷與氨基糖苷上的正電荷結(jié)合，從而有助于將其容納在RNA螺旋內(nèi)部環(huán)內(nèi)的結(jié)合袋中或核酶核心中，以進(jìn)行特定的接觸。研究發(fā)現(xiàn)，核酶中存在兩種類(lèi)型的氨基糖苷結(jié)合位點(diǎn)：第一種由不對(duì)稱(chēng)內(nèi)部環(huán)組成，如HIV的RRE和Tar結(jié)構(gòu)域中的解碼位點(diǎn)[23-24]。第二種結(jié)合位點(diǎn)是核酶催化核心中的金屬離子結(jié)合口袋[25]。在I型結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，作用方式可能是通過(guò)RNA結(jié)構(gòu)的輕微扭曲和干擾功能性底物的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的，而在II型結(jié)合位點(diǎn)中，氨基糖苷類(lèi)則通過(guò)置換必要的二價(jià)金屬離子起作用。核糖核酸酶P(核糖核酸酶P)是一種依賴(lài)Mg2+的核糖核酸內(nèi)切酶，負(fù)責(zé)tRNA前體5'端加工。在Mikkelsen等[26]研究發(fā)現(xiàn)RNase P在有或無(wú)RNase P蛋白時(shí)均可被幾種氨基糖苷類(lèi)抑制。

在過(guò)去的幾十年中，氨基糖苷類(lèi)抗生素對(duì)抗HIV-1的功效已經(jīng)被廣泛證明。HIV-1基因表達(dá)是由Tat激活的，Tat是一種病毒編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，它與一種稱(chēng)為T(mén)AR的病毒RNA序列相互作用，位于所有病毒mRNA的5-末端。Lapidot等[27]基于HIV-1 RNA結(jié)合的肽模型，基于Tat反應(yīng)元件-配體復(fù)合物和氨基糖苷- RNA相互作用的NMR結(jié)構(gòu)，以及HIV-1 Tat結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了氨基糖苷-精氨酸偶聯(lián)物(AACs)和氨基糖苷多精氨酸偶聯(lián)物(APACs)作為T(mén)at的模擬物，這些化合物通過(guò)與HIV-1 Tat反應(yīng)元件(TAR)RNA和HIV-1 Rev反應(yīng)元件(RRE)RNA相互作用調(diào)節(jié)RNA參與病毒生命周期的各個(gè)階段。除了作為T(mén)at拮抗劑，它們還可以通過(guò)阻斷HIV-1細(xì)胞進(jìn)入的幾個(gè)步驟來(lái)抑制HIV-1的感染性。AACs和APACs通過(guò)在cd4結(jié)合位點(diǎn)與gp120相互作用，通過(guò)在CXCR4 mAb 12G5結(jié)合位點(diǎn)與CXCR4相互作用，以及通過(guò)與gp41外區(qū)瞬時(shí)結(jié)構(gòu)相互作用抑制HIV-1細(xì)胞的進(jìn)入(圖1)[27-30]。

2 氨基糖苷類(lèi)抗生素的拓展應(yīng)用

2.1 氨基糖苷類(lèi)抗生素抑制PTCs的應(yīng)用研究

圖1 蛋白質(zhì)翻譯和氨基糖類(lèi)抗生素(AGs)作為無(wú)義抑制劑的作用機(jī)制Fig.1 The mechanism of protein translation and aminoglycoside antibiotics as nonsense inhibitors

框內(nèi)無(wú)義突變引起的遺傳性疾病，主要包括囊性纖維化(CF)[31]，Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)[32]，Usher綜合癥(USH)[33]以及Hurler綜合征(HS)，其分別涉及CFTR、dystrophin、PCDH15和IDUA蛋白基因的突變，導(dǎo)致翻譯過(guò)早終止并最終形成錯(cuò)誤截短的非功能性蛋白質(zhì)(表1)。氨基糖苷類(lèi)抗生素能夠抑制提前終止密碼子PTC的閱讀并恢復(fù)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的翻譯。

目前國(guó)外主要用于慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊性纖維化患者和非CF性慢性支氣管擴(kuò)張患者的藥物有妥布霉素吸入溶液(國(guó)外已批準(zhǔn)上市)、阿米卡星注射液和慶大霉素注射液。Du等[32]研究發(fā)現(xiàn)慶大霉素可以部分恢復(fù)DMD和CF[31]小鼠模型中功能蛋白的表達(dá)。CFTR蛋白的合成從正常水平的＜1%增加至5%，這可能會(huì)大大降低CF疾病的嚴(yán)重性[34-35]。2017年2月13日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了Vertex醫(yī)藥公司的Symdeko(tezacaftor/ivacaftor+ivacaftor)上市，用于治療12歲及以上的囊性纖維化患者。這也是Vertex獲得FDA批準(zhǔn)的第3種針對(duì)囊性纖維化根本病因的治療藥物。Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥發(fā)病機(jī)制主要為編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因DMD的無(wú)義突變過(guò)早地停止了抗肌萎縮蛋白的翻譯，由此導(dǎo)致的紊亂使得蛋白質(zhì)不能全部表達(dá)而不再起作用。Translana(Ataluren或PTC-124，CFTR-G542X 無(wú)義等位基因抑制劑)是歐洲藥品管理局(EMA)于2014年7月31日批準(zhǔn)的蛋白表達(dá)修復(fù)新藥，靶向致病基因編碼蛋白，通過(guò)促進(jìn)核糖體通讀來(lái)治療，允許繞過(guò)致病變異體并繼續(xù)翻譯過(guò)程以產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)[36]。

表1 氨基糖苷類(lèi)抗生素的應(yīng)用Tab.1 Application of aminoglycoside antibiotics

自1957年Schuknecht[37]首先提出氨基糖苷類(lèi)抗生素治療梅尼埃病并逐漸用于臨床，其治療效果也逐漸得到肯定。雙盲隨機(jī)對(duì)照的前瞻性研究以及循證醫(yī)學(xué)研究均已經(jīng)證實(shí)了鼓室注射慶大霉素對(duì)梅尼埃病患者眩暈控制的有效性[38]。Watson等[39]分析認(rèn)為鼓室內(nèi)注射低劑量的慶大霉素治療對(duì)控制梅尼埃病患者的癥狀有效，同時(shí)可以保留聽(tīng)力。Pullens等研究發(fā)現(xiàn)，在雙盲、安慰劑對(duì)照的關(guān)于鼓室內(nèi)慶大霉素對(duì)眩暈癥狀影響的隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，與安慰劑組相比，這兩項(xiàng)試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)慶大霉素組的眩暈癥狀明顯減少。鼓室注射慶大霉素(ITG)可能是根除梅尼埃病患者眩暈最有效的非手術(shù)治療，但也是具有不可忽視的聽(tīng)力損失風(fēng)險(xiǎn)的破壞性治療方法。ICON推薦對(duì)側(cè)前庭功能良好的患者在聽(tīng)力受損時(shí)優(yōu)先使用ITG作為破壞性治療方法[40]。

Usher綜合征是一種常染色體隱性遺傳病，患者先天性、雙側(cè)性耳聾，伴有視網(wǎng)膜色素變性(RP)引起的視力損害。迄今已經(jīng)鑒定出14個(gè)與user綜合征相關(guān)的致病基因，包括MYO7A、USH1C、USH1G、CDH23和PCDH15等。29%～50%的USH1型是由MYO7A表達(dá)不正常引起的。該基因含有49個(gè)外顯子，編碼2215個(gè)氨基酸。c.4513G＞ T (p.Glu1505Ter)突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)截短，激活無(wú)義介導(dǎo)的衰敗(NMD)途徑。目前已經(jīng)開(kāi)始使用TranslarnaTM(也稱(chēng)為ataluren或PTC124)進(jìn)行無(wú)虹膜的試驗(yàn)(NCT02647359)。同樣，賀勒氏癥主要由編碼α-L-艾杜糖醛縮酶(IDUA)的基因突變導(dǎo)致的，酶替代療法(ERT)目前正在使用或正在測(cè)試中。Aldurazyme是首個(gè)用于治療包括Hurler綜合征在內(nèi)的黏多糖貯積癥I(MPS-I)的生物制劑。Wang等[41]利用重組腺病毒相關(guān)載體，通過(guò)Cas9/sgRNA系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

盡管氨基糖苷類(lèi)抗生素已顯示出對(duì)PTCs抑制治療應(yīng)用具有相當(dāng)大的潛力，但實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中仍然存在一些問(wèn)題。氨基糖苷類(lèi)(如慶大霉素)不易溶于脂質(zhì)，全身給藥時(shí)難以穿透細(xì)胞[42]。最值得注意的是，這些藥物仍難以穿過(guò)血視網(wǎng)膜或血腦屏障，有效全身性輸送至視網(wǎng)膜或腦脊液的挑戰(zhàn)仍然存在。目前已經(jīng)在嘗試?yán)弥|(zhì)體包囊氨基糖苷以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)遞送，以期通過(guò)增加藥物向細(xì)胞質(zhì)的遞送來(lái)優(yōu)化治療效果[43]。2009年，Nudelman等[19]報(bào)道了與慶大霉素相比，新型氨基糖苷類(lèi)衍生物(NB54)的開(kāi)發(fā)具有更好的通讀效率和更低的毒性。該化合物在體外模擬針對(duì)具有引起疾病的無(wú)義突變的基因的DNA片段進(jìn)行測(cè)試。NB54表現(xiàn)出針對(duì)DMD、HS以及CF等病癥有關(guān)的基因的增強(qiáng)的PTC抑制能力。Nudelman等的研究基于優(yōu)化藥物潛在的抑制功效和毒性，為開(kāi)發(fā)氨基糖苷的新型結(jié)構(gòu)提供了新的方向。而在這個(gè)方向上的進(jìn)一步發(fā)展可能為治療由無(wú)義突變引起的許多遺傳疾病提供更多的可能性。

2.2 氨基糖苷類(lèi)抗生素抑制RNA酶的應(yīng)用研究

除了干擾遺傳密碼的翻譯外，氨基糖苷類(lèi)抗生素在體外還能抑制幾種核酶的活性。第一組內(nèi)含子自剪接[44]、錘頭狀核酶自剪接[45]、人類(lèi)肝炎病毒(HDV)核糖酶[46]、發(fā)夾狀核酶Mg2+誘導(dǎo)的自我剪接[47]以及RNase P RNA的tRNA加工活性[48]都可被相同的氨基糖苷類(lèi)抑制，最顯著的是新霉素B和妥布霉素。關(guān)于錘頭狀核酶的抑制，研究發(fā)現(xiàn)新霉素B至少與一個(gè)Mg2+競(jìng)爭(zhēng)，且抑制效率依賴(lài)于pH值，即與抗生素的質(zhì)子化氨基相關(guān)[49]。在沒(méi)有金屬離子的情況下，氨基糖苷類(lèi)抗生素還可以促進(jìn)發(fā)夾狀核酶的裂解反應(yīng)。發(fā)夾狀核酶不依賴(lài)于二價(jià)金屬離子進(jìn)行催化，但Mg2+會(huì)極大地促進(jìn)其折疊。新霉素B可以替代折疊所需的Mg2+，因此可以強(qiáng)烈刺激核酶的活性[47,50]。這與新霉素B對(duì)錘頭狀核酶的作用相反，后者通過(guò)從催化核心置換必需的Mg2+而被抗生素抑制。但Chia等[51]也發(fā)現(xiàn)HDV的核酶在體內(nèi)對(duì)氨基糖苷不敏感，盡管該核酶在體外是敏感的。

2018年11月，雷鳴團(tuán)隊(duì)成功解析了酵母內(nèi)源RNase P全酶及其與底物pre-tRNA的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)RNase P以一種“雙錨定(double anchor)”的機(jī)制來(lái)識(shí)別tRNA前體。tRNA的5'端被特異的錨定在催化中心以促使其完成切割反應(yīng)。底物tRNA的結(jié)合誘導(dǎo)了該酶催化中心一個(gè)關(guān)鍵殘基的巨大的構(gòu)象變化。結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬，他們提出了RNase P催化反應(yīng)的雙鎂離子模型[52]。新霉素B的結(jié)合會(huì)干擾二價(jià)金屬離子進(jìn)入RNA。綜上可知，氨基糖苷與Mg2+離子競(jìng)爭(zhēng)重要的二價(jià)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。因此，RNase P作為一種重要的酶，是一種潛在的藥物靶點(diǎn)，可作為多種氨基糖苷類(lèi)先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)新藥。

Lapidot等[27]基于HIV-1 RNA結(jié)合的肽模型，設(shè)計(jì)合成了氨基糖苷-精氨酸偶聯(lián)物(AACs)和氨基糖苷多精氨酸偶聯(lián)物(APACs)作為T(mén)at的模擬物。這些化合物分子靶向HIV-1 TAR或RRE，在較低的微摩爾范圍內(nèi)以50%的有效濃度抑制HIV-1的病毒復(fù)制，最有效的化合物是六精氨酸-新霉素B和九烷基-精氨酸-新霉素偶聯(lián)物。它們除了充當(dāng)Tat拮抗劑外，還通過(guò)阻止HIV-1細(xì)胞進(jìn)入的幾個(gè)步驟來(lái)抑制HIV-1感染性。用同一種化合物針對(duì)病毒生命周期中的幾個(gè)關(guān)鍵過(guò)程不僅可能提高其抗病毒功效，更重要的是，可能降低病毒對(duì)該化合物產(chǎn)生耐藥性的能力。因此，AACs和APACs可能成為開(kāi)發(fā)多靶點(diǎn)新型HIV-1抑制劑的先導(dǎo)化合物。

目前，人們已經(jīng)通過(guò)不同的方法，包括組合合成、高通量篩選和對(duì)現(xiàn)有氨基糖苷類(lèi)藥物的化學(xué)修飾等，來(lái)解決分離對(duì)獨(dú)特RNA基序特異性增強(qiáng)和對(duì)細(xì)胞毒性降低的新藥物的障礙[53-54]。通過(guò)化學(xué)修飾增加氨基糖苷的電荷和降低它們的堿度，可以增加它們對(duì)目標(biāo)RNA的親和力[55]。氨基糖苷的二聚體也可以增強(qiáng)對(duì)錘頭狀核酶的結(jié)合親和力[56]。所有這些新技術(shù)最終將有助于更好地理解抗生素與靶標(biāo)之間的相互作用，從而在已有抗生素的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出更高效低毒的抗生素。