氨基糖苷類抗生素作用機(jī)制研究進(jìn)展

劉海燕 殷瑜

(1 中國藥科大學(xué)，南京 211198；2 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

氨基糖苷類抗生素作為一種殺菌性抗菌藥物[1]，其具有抗菌譜廣、殺菌完全、與β-內(nèi)酰胺類抗生素協(xié)同作用好等特點(diǎn)[2]。由于氨基糖苷類抗生素潛在的毒副作用具體包括引起患者神經(jīng)肌肉阻滯作用、耳毒性、腎毒性[3]等及耐藥菌的產(chǎn)生[4]而限制了其在臨床上的大量使用，但它們?nèi)允侵委煾锾m陰性菌嚴(yán)重感染的重要藥物。此外，這類藥物的新用途也逐漸被發(fā)現(xiàn)，包括用于治療遺傳性疾病[5]、梅尼埃病[6]及抗HIV病毒[7]等。本文簡要介紹了氨基糖苷類抗生素的歷史、臨床常用種類，重點(diǎn)闡述了其作用機(jī)制。

1 氨基糖苷類抗生素簡介

1.1 氨基糖苷類抗生素的歷史追溯

氨基糖苷類抗生素是一類由單組分或多組分糖基取代的氨基環(huán)醇類化合物[8]。1944年，鏈霉素作為第一個(gè)氨基糖苷抗生素被發(fā)現(xiàn)[9]并沿用至今。之后新霉素(1949)[10]、卡那霉素(1957)[11]和慶大霉素[12]也相繼被發(fā)現(xiàn)。目前為止，已報(bào)道的天然和半合成氨基糖苷類抗生素的總數(shù)已超過3000種，其中微生物產(chǎn)生的天然氨基糖苷類抗生素有近200種[2]。2017年，一種新型氨基糖苷類抗生素plazomicin出現(xiàn)，于10月份向美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)提交新藥申請(qǐng)，并于2018年6月底獲得FDA批準(zhǔn)，用于由某些腸桿菌科細(xì)菌感染引起的、治療選擇非常有限或無治療選擇的復(fù)雜性尿路感染[13]。

1.2 臨床常用的氨基糖苷類抗生素

國內(nèi)，臨床上常用的氨基糖苷類抗生素包括：新霉素、卡那霉素和妥布霉素等[14]，根據(jù)抗菌藥物臨床使用指南[15]整理見表1。此外，在迄今已知的眾多氨基糖苷類抗生素中，5種(阿米卡星，慶大霉素，新霉素，鏈霉素和妥布霉素)被列入英國國家處方集，用于臨床，7種(阿米卡星，慶大霉素，新霉素，鏈霉素，卡那霉素，巴龍霉素和妥布霉素)經(jīng)FDA批準(zhǔn)在美國臨床使用[13,16]。

2 氨基糖苷類抗生素作用機(jī)制

2.1 氨基糖苷類抗生素經(jīng)典的殺菌作用機(jī)制

氨基糖苷類抗生素殺死細(xì)菌，主要通過“三步曲”抑制蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第一步，由于這類抗生素具有陽離子的性質(zhì)，所以首先與細(xì)菌表面的陰離子化合物結(jié)合。在革蘭陰性菌中，陰離子化合物包括脂多糖，磷脂和外膜蛋白，在革蘭陽性菌中，主要是磷壁酸和磷脂。陰陽離子相互作用使細(xì)菌表面滲透性增加，從而導(dǎo)致一些氨基糖苷分子滲透到細(xì)菌的周質(zhì)空間中[17]。第二步為“能量依賴性階段I”，少數(shù)抗生素分子在功能性電子傳遞系統(tǒng)的參與下到達(dá)細(xì)胞質(zhì)[18]。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的氨基糖苷類分子產(chǎn)生抗生素效應(yīng)，從而產(chǎn)生錯(cuò)誤翻譯的蛋白質(zhì)。異常的細(xì)胞質(zhì)膜蛋白破壞細(xì)胞質(zhì)膜完整性，從而促進(jìn)氨基糖苷類分子的大量進(jìn)入。第三步稱為“能量依賴階段II”[19]。細(xì)胞內(nèi)的大量氨基糖苷分子使蛋白質(zhì)合成過程中產(chǎn)生大量錯(cuò)誤，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜中更多的損傷，允許更高的抗生素?cái)z取速率，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

30S核糖體亞基與tRNA的結(jié)合是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵步驟之一，目前發(fā)現(xiàn)的所有氨基糖苷類抗生素其主要作用位點(diǎn)都為30S核糖體的16S rRNA。但隨著現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)分子水平上不同氨基糖苷抗生素之間又存有區(qū)別。

表1 國內(nèi)臨床常用氨基糖苷類抗生素及作用范圍[15]Tab.1 Domestic clinical commonly used aminoglycoside antibiotics and their actions[15]

2.1.1 抗生素與30S核糖體16S rRNA的A部位結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)譯

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，氨基糖苷類抗生素與30S核糖體的相互作用逐漸被揭示，其主要與30S核糖體16S rRNA的A部位結(jié)合以造成蛋白質(zhì)的錯(cuò)譯從而起到殺菌作用[20]。蛋白質(zhì)的翻譯過程，涉及到核糖體、tRNA和mRNA 3者的準(zhǔn)確結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)位于30S與50S核糖體亞基的相互作用面上，具體分為A、P、E 3個(gè)位點(diǎn)[21]。其中A位點(diǎn)為解碼區(qū)，由3個(gè)腺嘌呤A1408、A1492、A1493在Helix44處通過2個(gè)G-C堿基對(duì)組成一個(gè)不對(duì)稱內(nèi)環(huán)。翻譯過程中，mRNA在與其匹配的tRNA結(jié)合后，該不對(duì)稱內(nèi)環(huán)會(huì)發(fā)生外翻，從而便于核糖體上A1492、A1493與mRNA及其匹配的tRNA的結(jié)合，結(jié)合后恢復(fù)內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，這種有序的構(gòu)象變化過程被嚴(yán)格控制以確保核糖體在解碼過程中精確識(shí)別并結(jié)合與mRNA互補(bǔ)配對(duì)的tRNA，最終實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)翻譯的準(zhǔn)確性[22]。而氨基糖苷類抗生素能夠插入16S rRNA的Helix44內(nèi)部，并與A位點(diǎn)的3個(gè)腺嘌呤形成氫鍵使得內(nèi)環(huán)外翻，該構(gòu)型與核糖體與mRNA和tRNA結(jié)合后的構(gòu)型相似，因而處于該構(gòu)型的核糖體更易與mRNA和tRNA結(jié)合，同時(shí)非互補(bǔ)配對(duì)的tRNA也能夠結(jié)合于mRNA上，最終導(dǎo)致錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的形成[23]，具體如圖1所示。

2.1.2 抑制30S核糖體亞基的組裝

1968年，Traub等[24]通過在體外改變核糖體蛋白的加樣順序發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白與16S rRNA的結(jié)合具有分級(jí)順序，同時(shí)該結(jié)合是一個(gè)熱力學(xué)依賴的過程。之后，Held等[25]的研究表明在30S核糖體亞基組裝過程中存在兩個(gè)中間體，分別為低溫下(0～15℃)裝配暫停時(shí)，沉降系數(shù)在21～22s的中間體RI和當(dāng)溫度升至 40℃時(shí)，組裝繼續(xù)進(jìn)行，RI吸收能量重排后形成的另一個(gè)沉降系數(shù)在25～26S的中間體RI*，在RI*中間體中加入剩余的核糖體蛋白，其最終組裝為有活性的30S亞基，具體如圖1所示。

近年來，Mehta和Champney[26-27]的研究表明，氨基糖苷類抗生素對(duì)30S核糖體亞基具有二級(jí)抑制靶點(diǎn)，且已經(jīng)在大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌中揭示新霉素和巴龍霉素在細(xì)胞生長過程中抑制30S核糖體亞基組裝，但是對(duì)50S亞基形成沒有影響。在上述兩項(xiàng)研究中，產(chǎn)生了裝配中間體，沉降系數(shù)為21S。這些研究工作是氨基糖苷類抗生素在體內(nèi)抑制30S亞基組裝的第一個(gè)標(biāo)識(shí)。隨后Foster等[28]進(jìn)一步描述了在新霉素或巴龍霉素作用下生長的大腸埃希菌細(xì)胞中產(chǎn)生的裝配中間體的特征，揭示氨基糖苷類抗生素能刺激30S組裝過程重21S前體的積累；雜交實(shí)驗(yàn)表明，前體顆粒中含有未加工的16S rRNA，同時(shí)在每種藥物抑制后，前體中發(fā)現(xiàn)了10種30S核糖體蛋白。這項(xiàng)工作實(shí)際是對(duì)Mehta和Champney研究的佐證。此外，Belousoff等[29]也闡明了新霉素和巴龍霉素的主要抑菌作用在于抑制30S核糖體亞基的組裝。

圖1 氨基糖苷類抗生素殺菌機(jī)制Fig.1 Bactericidal mechanism of aminoglycoside antibiotics

2.2 產(chǎn)生羥基自由基

Collins等[30]發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類等殺菌性抗生素作用于細(xì)菌后，都產(chǎn)生了大量的羥基自由基，而抑菌性抗生素均未能促使羥基自由基的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入芬頓反應(yīng)抑制劑—鐵離子螯合劑2,2'-聯(lián)吡啶后，氨基糖苷類等殺菌性抗生素對(duì)菌體的殺死率明顯降低，說明羥基自由基的形成和芬頓反應(yīng)在氨基糖苷類抗生素殺菌機(jī)制中起著重要作用。進(jìn)一步研究表明，氨基糖苷類等殺菌性抗生素與細(xì)菌接觸后，激發(fā)三羧酸循環(huán)(TCA)產(chǎn)生的NADH不斷通過電子傳遞鏈發(fā)生氧化，導(dǎo)致NADH被大量消耗，進(jìn)而引起細(xì)菌產(chǎn)生大量的超氧化物。超氧化物進(jìn)一步損壞鐵硫簇，使其釋放出的亞鐵離子通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量的羥基自由基，促使細(xì)菌胞內(nèi)DNA、蛋白和脂質(zhì)損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，具體的殺菌代謝通路如圖1所示。

但是近年來，關(guān)于殺菌性抗生素是否通過產(chǎn)生羥基自由基殺死細(xì)菌也存在很多質(zhì)疑。2013年，Liu等[31]的研究指出，細(xì)菌暴露于殺菌性抗生素不會(huì)依賴羥基自由基造成細(xì)菌的損傷，更可能是直接抑制細(xì)胞壁組裝、蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制。同年，Keren等[32]的研究也指出在抗生素存在下，個(gè)體細(xì)胞的存活概率與其ROS水平之間沒有相關(guān)性。

2.3 其他作用機(jī)制

氨基糖苷類抗生素除了上述作用機(jī)制以外，隨著研究的深入，還發(fā)現(xiàn)一些氨基糖苷類抗生素具有新的作用機(jī)制，具體包括抑制核糖核酸酶P的活性，改變細(xì)菌轉(zhuǎn)錄率和抑制細(xì)菌分裂。

核糖核酸酶P(RNase P)是一種Mg2+依賴性核糖核酸內(nèi)切酶，負(fù)責(zé)tRNA 5'端的成熟[33]。有研究表明，在氨基糖苷類抗生素如新霉素和卡那霉素作用下，能夠抑制核糖核酸酶P(RNase P)的活性[34]。Kawamoto等[35]還發(fā)現(xiàn)新霉素的六精氨酸衍生物作為一種核糖核酸酶P的抑制劑，較新霉素對(duì)核糖核酸酶的抑制作用更好；此外Goh等[36]的研究表明亞抑制濃度的氨基糖苷類抗生素可以改變細(xì)菌轉(zhuǎn)錄率；Possoz等[37]的研究還發(fā)現(xiàn)阿米卡星在亞抑制濃度下會(huì)破壞Z環(huán)的形成，從而抑制細(xì)胞分裂。

3 結(jié)論與展望

近年來，隨著氨基糖苷類抗生素的廣泛使用，氨基糖苷類抗生素的耐藥狀況日益嚴(yán)重，科研人員正在積極地進(jìn)行新型氨基糖苷類抗生素研究的探索。2016年，江南大學(xué)王雪玉等[38]利用糖芯片技術(shù)研究氨基糖苷類抗生素與rRNA和蛋白質(zhì)的相互作用，以篩選可以與RNA緊密結(jié)合并與抗性/毒性引起的蛋白質(zhì)具有較低親和力的新化合物，以期促進(jìn)新型氨基糖苷類抗生素的發(fā)現(xiàn)；2017年，鄭曌等[39]制備出一種酸刺激響應(yīng)的氨基糖苷類抗生素水凝膠，從而通過改變抗生素的劑量來實(shí)現(xiàn)藥物的按需遞送和實(shí)現(xiàn)不同的水凝膠降解率，以降低藥物的毒副作用和細(xì)菌的耐藥率。本文主要總結(jié)了氨基糖苷類抗生素經(jīng)典作用機(jī)制和其他作用機(jī)制，以期為獲得高效、廣譜抗菌、抗耐藥菌、低毒的新型氨基糖苷類抗生素的研究、開發(fā)和發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用。