MDR1基因多態(tài)性與美羅培南血藥濃度及臨床療效的相關(guān)性研究

許建文 黃品芳 吳京南 柯蒙 劉亦偉 林翠鴻

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，福州 350001)

美羅培南(meropenem)屬碳青霉烯類抗生素，為強(qiáng)效廣譜抗生素，對需氧菌、厭氧菌及多數(shù)革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均具有良好的抗菌作用，主要用于多重耐藥菌感染以及重癥感染的治療。美羅培南是治療嚴(yán)重細(xì)菌感染所致的肺炎、膿毒血癥、化膿性腦膜炎的常用藥物，其主要以原型經(jīng)腎臟消除，體內(nèi)藥動學(xué)過程復(fù)雜，導(dǎo)致血藥濃度個體差異，進(jìn)而影響其抗菌療效[1-2]。當(dāng)T＞MIC超過40%時(shí)，可有較好的殺菌效果，劑量不足易導(dǎo)致耐藥及治療失敗，而劑量過大易導(dǎo)致毒性反應(yīng)[3]。

研究表明，經(jīng)腎臟排泄的藥物，其血藥濃度與相應(yīng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性密切相關(guān)[4-5]。多重耐藥基因1(MDR1)編碼的P-糖蛋白(P-gp)作為藥物流出轉(zhuǎn)運(yùn)子，參與中性及陽離子藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)[6-7]。P-gp在腎近曲小管表達(dá)，其外排轉(zhuǎn)運(yùn)作用可提高藥物從腎臟排泄[8]。MDR1基因型的不同可影響P-gp的功能，在已發(fā)現(xiàn)MDR1的SNPs中，C3435T的多態(tài)性與P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)功能密切相關(guān)[9-11]。

本研究旨在探討MDR1的基因多態(tài)性與美羅培南血藥濃度及臨床療效的相關(guān)性，考察美羅培南血藥濃度個體差異的遺傳學(xué)特征，以期為臨床的精準(zhǔn)用藥提供理論支持。

1 材料、對象與方法

1.1 病例選擇

入選2018年1月—2018年11月就診于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為感染性疾病，接受美羅培南治療的101例住院患者。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

病原學(xué)診斷為細(xì)菌性感染的患者，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示病原菌對美羅培南敏感或依據(jù)經(jīng)驗(yàn)治療應(yīng)用美羅培南；年齡18～65歲，性別不限，美羅培南血藥濃度已達(dá)穩(wěn)態(tài)。排除重要臟器功能衰竭，發(fā)生嚴(yán)重感染等藥物不良反應(yīng)，合并用藥影響腎排泄的患者。療效判定：依據(jù)《抗菌藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》分為有效和無效。

1.3 試劑與儀器

注射用美羅培南(規(guī)格：0.5g/瓶，Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.生產(chǎn))，美羅培南對照品(批號：130506-200702，含量：100%)(中國食品藥品檢定研究院)。Waters高效液相色譜儀(美國Waters公司產(chǎn)品)，PCR儀(美國Bio-Rad公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)。

1.4 血藥濃度檢測

患者靜脈滴注美羅培南達(dá)穩(wěn)態(tài)后，給藥前30min采集外周靜脈血2mL，離心之后取上層血漿100μL，用蛋白沉淀法處理血漿樣品，采用HPLC法測定血藥濃度。

1.5 基因型檢測

采用血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，提取患者血液中基因組DNA，微量核酸測定儀測定DNA的濃度， -20℃保存。PCR擴(kuò)增MDR1，引物序列為上游(P1)：5'-ACTCTTGTTTTCAGCTGCTTG-3'，下游(P2)：5'-AGAGACTTACATTAGGCAGTGACTC-3'，擴(kuò)增片段為231bp，酶切后產(chǎn)生163和68bp。PCR反應(yīng)體系25μL，DNA模板4μL，TaqPCR Master Mix 12.5μL，正反向引物都是0.3μL，滅菌注射用水7.9μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，以下步驟進(jìn)行35個循環(huán)：94℃變性30s，54℃退火30s，最后72℃再延伸1min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Levene檢驗(yàn)對正態(tài)分布的變量進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以(±s)表示，計(jì)數(shù)資料用率表示。非正態(tài)分布資料用中位數(shù)P25以及四分位數(shù)P75表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)或MANNWhitney U檢驗(yàn)。χ2檢驗(yàn)等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究共納入101例患者中，性別、年齡、體質(zhì)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，美羅培南劑量和血藥濃度等方面的一般資料見表1。

2.2 患者血藥濃度

101例患者中，若首次測得的血藥濃度小于5μg/mL及大于20μg/mL且臨床療效不佳的患者，則重復(fù)監(jiān)測其濃度。共測得穩(wěn)態(tài)血藥濃度172例，其中68.0%的濃度小于10μg/mL；54.0%的濃度小于5μg/mL(表2)。

2.3 血藥濃度與臨床療效的關(guān)聯(lián)性

5～10μg/mL與10～20μg/mL濃度范圍美羅培南的臨床有效率(83.3%,91.7%)顯著高于5μg/mL以下濃度范圍(44%)(P＜0.05)，5～10μg/mL與10～20μg/mL濃度范圍美羅培南的臨床有效率相近(P＞0.05，表3)。

表2 患者血藥濃度Tab.2 Distribution of concentration of meropenem

2.4 C3435T基因多態(tài)性分布

CC基因型患者39例(38.6.0%)，CT基因型患者48例(44.8%)，TT基因型患者14例(16.3%)。這3個位點(diǎn)的基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。

2.5 C3435T基因多態(tài)性與濃度和濃度/劑量比的關(guān)聯(lián)性

不同MDR1C3435T基因型患者的濃度和濃度/劑量比結(jié)果相近(P＞0.05，表4)。

2.6 C3435T基因多態(tài)性與臨床療效的關(guān)聯(lián)性

不同MDR1C3435T 基因型患者的臨床有效率相近(P＞0.05，表5)。

3 討論

美羅培南具有強(qiáng)大的殺菌活性，因其誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的概率低，是唯一適用于治療細(xì)菌性腦膜炎的碳青霉烯類抗生素。如何合理應(yīng)用抗菌藥物，提高療效，降低毒副作用，延緩細(xì)菌耐藥，是當(dāng)今臨床的迫切任務(wù)。治療藥物濃度監(jiān)測(TDM)及基因檢測理論有助于臨床制定抗菌藥物給藥方案，減緩耐藥菌株的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，美羅培南的濃度5～10μg/mL 與10～20μg/mL濃度范圍美羅培南的臨床有效率(83.3%,91.7%)顯著高于5μg/mL以下濃度范圍(44%)(P＜0.05)，然而5～10μg/mL與10～20μg/mL濃度范圍美羅培南的臨床有效率無顯著差異(P＞0.05)。因此，加強(qiáng)美羅培南血藥濃度監(jiān)測，結(jié)合患者病情優(yōu)化用藥方案，可提高臨床治療效果，降低不良反應(yīng)及耐藥性的產(chǎn)生，同時(shí)減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

表3 美羅培南血藥濃度與臨床療效的關(guān)聯(lián)性Tab.3 Relationship between the curative effect and concentration of meropenem

美羅培南進(jìn)入體內(nèi)后，54%～79%以原型經(jīng)腎臟排泄，因此其血藥濃度可能與腎臟藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體密切相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與一些疾病的發(fā)生及藥效的變化具有密切相關(guān)性[5-6,12]。已發(fā)現(xiàn)的MDR1基因29個單核苷酸多態(tài)性中，26外顯子C3435T基因多態(tài)性與MDR1及P-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)的功能和表達(dá)密切相關(guān)[13-14]。P-gp參與許多藥物的腎小管分泌或再吸收過程，近端腎小管刷狀緣膜是腎小管分泌藥物的主要部位，該部位P-gp高度表達(dá)。P-gp對腎小管分泌具有重要作用[12,15]，P-gp是藥物流出轉(zhuǎn)運(yùn)子，能夠影響藥物吸收。MDR1C3435T某基因型的差異可導(dǎo)致P-gp功能的改變，影響血藥濃度水平[16-18]。本研究檢測得到MDR1C3435T各基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示具有群體代表性。測得MDR1C3435T突變率(37.6%)與先前研究[19-20]報(bào)道的的突變率(36.61%)基本一致。然而，可能受到樣本量的限制，本文未發(fā)現(xiàn)MDR1C3435T多態(tài)性與美羅培南血藥濃度以及臨床療效間明顯的相關(guān)性。

綜上所述，本研究可為美羅培南血藥濃度個體化差異提供基因組學(xué)的解釋，為美羅培南臨床抗感染方案中劑量的制定提供理論依據(jù)。后續(xù)研究可結(jié)合藥效學(xué)指標(biāo)綜合分析，對以上推測進(jìn)行考證。

表4 C3435T基因多態(tài)性與美羅培南濃度和濃度/劑量比的關(guān)聯(lián)性Tab.4 Relationship between gene polymorphisms of MDR1 and the plasma concentration of meropenem

表5 C3435T基因多態(tài)性與美羅培南臨床療效的關(guān)聯(lián)性Tab.5 Relationship between gene polymorphisms of MDR1 and the clinical efficacy of meropenem