生物卵膜促進(jìn)小鼠全層皮膚損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究△

李瑾 蔡晶

(山東大學(xué)附屬山東省耳鼻喉醫(yī)院耳外科 濟(jì)南 250022)

在耳科，很多疾病都可造成外耳道狹窄或皮膚缺損，在去除病變或行外耳道成形術(shù)中，要用到各類皮瓣或皮片來(lái)修復(fù)外耳道皮膚缺損。但由于患者供皮區(qū)有限，自體皮膚移植修復(fù)創(chuàng)面一直受到限制。因此，使用其他類型的皮膚替代物來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面愈合已成為迫切的需要。生物卵膜是一種接近生理狀態(tài)的生物半透明膜，有良好的組織相容性，無(wú)毒，無(wú)免疫原性，具有殺菌、抗炎、營(yíng)養(yǎng)保護(hù)創(chuàng)面和促進(jìn)局部血液循環(huán)的功能。生物卵膜可促進(jìn)壓瘡和糖尿病患者難治性創(chuàng)傷的恢復(fù)[1-3]。本實(shí)驗(yàn)以6～8周的健康雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)制備全層皮膚損傷創(chuàng)面，觀察生物卵膜對(duì)小鼠皮膚損傷的修復(fù)作用，以期為將來(lái)在耳科的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性C57BL/6小鼠40只(由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，6～8周齡，體重(20±2)g，飼養(yǎng)于山東省耳鼻喉研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障環(huán)境(溫度20～23 ℃，濕度50%～60%)。1%戊巴比妥鈉(北京冬哥科技有限公司)。

1.2 造模與分組 取40只健康雄性C57BL/6小鼠，采用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg體重進(jìn)行腹腔麻醉，備皮，75%乙醇消毒背部，標(biāo)記。通過(guò)眼科剪造成3個(gè)分散分布、深及筋膜、直徑2 mm、相同大小的背部皮膚缺損創(chuàng)面，隨機(jī)分為5組，每組8只：生物卵膜組、生物卵膜+蛋清液組、莫匹多星(商品名：百多邦)組、聚維酮碘(碘伏)組和對(duì)照組。生物卵膜的制備：取新鮮雞蛋，將其擦干，敲破蛋殼后使用無(wú)菌持物鉗將雞蛋內(nèi)膜輕輕剝出。生物卵膜組在創(chuàng)面覆蓋生物卵膜，于邊角細(xì)線固定縫合1針；生物卵膜+蛋清液組是在此基礎(chǔ)上每日涂抹新鮮蛋液于生物卵膜上方；莫匹多星組不予生物卵膜覆蓋且每日早晨涂抹適量莫匹多星1次；聚維酮碘組不予生物卵膜覆蓋且每日早晨涂抹適量聚維酮碘1次；對(duì)照組不予生物卵膜覆蓋且不涂抹藥物(圖1)。每只小鼠的3個(gè)傷口確保有1個(gè)為對(duì)照，1個(gè)為生物卵膜覆蓋。連續(xù)給藥，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，每日觀察并做記錄，對(duì)比相同大小皮膚缺損的愈合情況。5組于造模后第6天、第12天采用Image Proplusv 1.5圖像分析系統(tǒng)測(cè)量殘余創(chuàng)面面積，比較各組平均愈合時(shí)間。

1.3 創(chuàng)面愈合時(shí)間及愈合率評(píng)價(jià) 每日觀察創(chuàng)面愈合時(shí)間和創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合判斷標(biāo)準(zhǔn)：痂皮脫落，新上皮生成。分別于造模后第6天和第12天給創(chuàng)面拍照，采用Image Proplusv 1.5圖像分析系統(tǒng)測(cè)量殘余創(chuàng)面面積。創(chuàng)面愈合率=[(A1-A2)/A1]×100%，其中，A1代表原創(chuàng)傷面積，A2代表不同時(shí)間觀察創(chuàng)傷面積；同時(shí)計(jì)算各組動(dòng)物創(chuàng)面平均愈合天數(shù)。

圖1. 造模與分組 A.備皮；B.制作3個(gè)傷口；C、D.不同處理措施。1傷口固定為生物卵膜覆蓋；2傷口固定為生物卵膜+蛋清液干預(yù)；3傷口固定為空白對(duì)照；4傷口為莫匹多星或者聚維酮碘干預(yù)

2 結(jié)果

2.1 小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)傷愈合的形態(tài)觀察 小鼠全層皮膚切除創(chuàng)傷，肌肉組織完全暴露。由于傷到皮膚中的毛細(xì)血管，會(huì)少量出血，但很快止住。生物卵膜在創(chuàng)面上的覆蓋時(shí)間保證在4～5 d。術(shù)后第6天，各組肉芽組織明顯增多，呈深紅色，可見(jiàn)毛細(xì)血管及創(chuàng)面收縮，創(chuàng)腔逐漸被肉芽組織填平，創(chuàng)緣新生上皮生長(zhǎng)明顯，創(chuàng)緣可見(jiàn)瘢痕組織形成。生物卵膜組和聚維酮碘組顏色較對(duì)照組皮膚淺，無(wú)毛發(fā)生長(zhǎng)，創(chuàng)面為肉芽組織覆蓋，創(chuàng)緣新皮較薄，透明，逐漸縮小呈瘢痕愈合。生物卵膜+蛋清液組和莫匹多星組創(chuàng)面較紅，伴有水腫。對(duì)照組創(chuàng)面痂皮覆蓋明顯。術(shù)后第12天，對(duì)照組創(chuàng)面仍處于增殖修復(fù)期，新長(zhǎng)出的表皮向創(chuàng)面中心爬行，逐漸覆蓋創(chuàng)面；其余4組創(chuàng)面上皮化明顯、收縮明顯。生物卵膜組和聚維酮碘組基本愈合，瘢痕淡化，修復(fù)完全，幾乎看不到創(chuàng)面痕跡。再次造模擴(kuò)大創(chuàng)面為直徑3 mm，亦觀察到生物卵膜組較對(duì)照組創(chuàng)面愈合得完全且迅速。詳見(jiàn)圖2、3。

圖2. 各組小鼠不同時(shí)間段皮膚創(chuàng)傷愈合情況(創(chuàng)面直徑為2 mm) A～E.各組造模后第6天皮膚愈合情況；F～J.各組造模后第12天皮膚愈合情況

圖3. 生物卵膜促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合(擴(kuò)大創(chuàng)面直徑為3 mm) A、B.生物卵膜組第6天、第12天皮膚愈合情況；C、D.對(duì)照組第6天、第12天皮膚愈合情況

2.2 小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合率 術(shù)后第6天，各組創(chuàng)面收縮，生物卵膜組和聚維酮碘組創(chuàng)面收縮率最為明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；生物卵膜+蛋清液組和莫匹多星組的愈合率較生物卵膜組和聚維酮碘組的愈合率低，但較對(duì)照組愈合率高(P<0.05)。術(shù)后第12天，除對(duì)照組創(chuàng)面尚未完全愈合，其余4組創(chuàng)面基本愈合。

2.3 小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合時(shí)間 對(duì)照組的愈合時(shí)間為(13.38±0.52)d，生物卵膜+蛋清液組和莫匹羅星組的愈合時(shí)間較對(duì)照組略短(P<0.05)，生物卵膜組和聚維酮碘組的愈合時(shí)間最短(P<0.05)，分別為(8.25±0.46)d和(8.5±0.53)d，2組愈合時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠創(chuàng)面愈合率及平均愈合時(shí)間比較()

注：a示與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

3 討論

耳郭、外耳道常見(jiàn)腫瘤切除或外耳道重建術(shù)后，為避免外觀畸形或耳道再次閉鎖或狹窄，還應(yīng)修復(fù)缺損皮膚[4]。但耳部皮膚皮下組織少，與軟骨膜粘連較緊，可移動(dòng)性差，尤其是一些小面積的缺損，雖看似缺損面積不大，但如直接縫合則傷口張力過(guò)大，不易愈合或局部變形，使得臨床修復(fù)有一定難度[5-6]。目前常用的修復(fù)方法主要是局部轉(zhuǎn)移患者耳部鄰近皮瓣、斷層皮片或覆蓋生物材料[7-8]。若轉(zhuǎn)移皮瓣，會(huì)犧牲鄰近組織的正常結(jié)構(gòu)，造成第2個(gè)術(shù)區(qū)，增加手術(shù)創(chuàng)傷和患者痛苦；若行皮片移植，存在皮片不成活或愈合不良的情況[9]；而選取一種新的修復(fù)材料一直是耳鼻喉醫(yī)師關(guān)注的課題。

本研究通過(guò)建立小鼠皮膚全層缺損創(chuàng)面模型，發(fā)現(xiàn)生物卵膜對(duì)皮膚缺損愈合有促進(jìn)作用。全層缺損創(chuàng)面可以模擬臨床上常見(jiàn)的皮膚缺損，探索促進(jìn)缺損創(chuàng)面愈合的治療措施，對(duì)臨床上治療創(chuàng)傷、潰瘍等皮膚缺損有較好的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)中，我們未選取耳部區(qū)域造模，是因?yàn)樾∈蠖坎灰坠潭ㄉ锫涯?，?dāng)頭部活動(dòng)時(shí)生物卵膜極易脫落，而背部皮膚平坦，面積較大，固定牢靠，所以選擇在背部區(qū)域建模。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，生物卵膜組和聚維酮碘組創(chuàng)面肉芽組織形成較早，創(chuàng)面收縮明顯，愈合時(shí)間最短，且創(chuàng)面平整、瘢痕少。生物卵膜+蛋清液組的愈合時(shí)間略長(zhǎng)，但優(yōu)于對(duì)照組。蛋清液未體現(xiàn)修復(fù)優(yōu)勢(shì)可能與蛋清液使得傷口潮濕，不利于創(chuàng)面恢復(fù)有關(guān)。莫匹羅星組的愈合情況與生物卵膜+蛋清液組類似，莫匹羅星的抗菌效果也未見(jiàn)明顯優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明抗感染在小鼠皮膚愈合過(guò)程中不是最主要的因素。

生物卵膜主要指雞蛋殼的白色內(nèi)膜，其組織修復(fù)效果主要通過(guò)以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)：①含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等，可使創(chuàng)面的營(yíng)養(yǎng)狀況得到改善，利于上皮組織細(xì)胞生長(zhǎng)；②無(wú)毒、抗原性弱，是一種接近生理狀態(tài)的半透膜，給創(chuàng)面營(yíng)造一個(gè)微酸、低氧、相對(duì)無(wú)菌、適度濕潤(rùn)的微環(huán)境，是良好的天然生物性敷料；③新鮮生物卵膜含有一種溶菌酶，可以對(duì)異種生物的細(xì)胞壁起到分解作用，具備消炎、殺菌功效；④有一定的黏性、彈性和力學(xué)強(qiáng)度，易與創(chuàng)緣緊貼，可起到橋梁、支架作用，利于增生移行的上皮細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。

本研究中，生物卵膜組和聚維酮碘組對(duì)小鼠全層皮膚損傷修復(fù)效果相當(dāng)。但這只是針對(duì)2 mm的小傷口，當(dāng)傷口擴(kuò)大時(shí)，生物卵膜獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，考慮與生物卵膜充當(dāng)支架，利于上皮細(xì)胞爬行生長(zhǎng)有關(guān)。針對(duì)小缺損，聚維酮碘的修復(fù)作用與生物卵膜相近，推測(cè)與聚維酮碘不斷釋放出游離碘，廣譜抗微生物，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，利于創(chuàng)面干燥有關(guān)[10]。但聚維酮碘應(yīng)用偶有過(guò)敏現(xiàn)象出現(xiàn)[11]。在耳科術(shù)后，對(duì)于聚維酮碘或碘仿紗條過(guò)敏的患者，可嘗試應(yīng)用生物卵膜貼敷來(lái)替換碘仿紗條+植皮。生物卵膜作為鼓膜貼補(bǔ)材料可以明顯提高鼓膜穿孔的愈合率已經(jīng)有許多報(bào)道[5]。盡管小鼠皮膚和人的皮膚存在差別，生物卵膜的療效在臨床中需進(jìn)一步驗(yàn)證，但本實(shí)驗(yàn)中生物卵膜可以明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合速度，切實(shí)為臨床皮膚損傷修復(fù)提供新的治療方法。