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    雙氫青蒿素對(duì)SLE小鼠巨噬細(xì)胞mRNAm6A甲基化的影響研究

    2020-04-28 09:25:12李姝玉楊詩(shī)帆洪嶺
    浙江醫(yī)學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:雙氫青蒿素甲基化

    李姝玉 楊詩(shī)帆 洪嶺

    系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種免疫紊亂引起的自身免疫性疾病,常引起多器官損傷。目前臨床只能使用會(huì)引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)的激素類和免疫抑制劑類藥物治療SLE,探尋SLE的特效藥物是科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。作為傳統(tǒng)中藥的代表,青蒿素在治療和控制瘧疾上效果顯著,為世界人民的健康做出了巨大的貢獻(xiàn)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)青蒿素對(duì)SLE的治療也具有一定的效果。青蒿素類衍生物可以抑制SLE小鼠產(chǎn)生自身抗體、減輕組織損傷并延長(zhǎng)SLE小鼠的生命[2]。DNA甲基化在SLE發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,低甲基化狀態(tài)可誘導(dǎo)SLE發(fā)病或加重。N6-腺嘌呤(m6A)甲基化是真核生物中最廣泛的一種化學(xué)修飾[3]。m6A甲基化修飾主要位于外顯子的終止密碼子及3′-UTRs附近區(qū)域[4-5]。m6A甲基化修飾可影響mRNA的剪接、出核、穩(wěn)定性和翻譯等RNA代謝過(guò)程,并且經(jīng)過(guò)甲基化修飾后的mRNA可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。m6A甲基化修飾的可逆調(diào)控和發(fā)揮其生物學(xué)功能需要甲基化轉(zhuǎn)移酶(METTL3)、去甲基化修飾酶(ALKBH5和 FTO)以及特異性的識(shí)別甲基化位點(diǎn)蛋白(TLR7和TLR9)的參與?;诖?,本研究采用實(shí)驗(yàn)室研究的方法,探討雙氫青蒿素是否通過(guò)影響SLE小鼠巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平發(fā)揮治療作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料 6周齡SPF級(jí)雌性MRL/lpr SLE小鼠20只,購(gòu)自上海南方模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。DMSO和雙氫青蒿素(純度98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Antimouse METTL3、Anti-mouse ALKBH5、Anti-mouse FTO、Anti-mouse TLR7、Anti-mouse TLR9 和 Anti-mouse β-Actin均購(gòu)自于美國(guó)Abcam公司;m6A(202003)抗體購(gòu)自德國(guó)Synaptic Systems公司。DMEM和FBS均購(gòu)自美國(guó)PAA公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

    1.2 方法

    1.2.1 小鼠巨噬細(xì)胞的分離 具體參照文獻(xiàn)[6]。將3%脫水硫羥乙酸培養(yǎng)基2ml注入小鼠腹腔,3~4d后將小鼠以頸椎脫臼法處死;處死后的小鼠以75%乙醇溶液浸泡5min,取出小鼠,腹面朝上,用鑷子撕開皮膚,完全暴露腹膜;然后用20ml注射器往腹腔注入10ml無(wú)血清培養(yǎng)基,針尖朝上,避開腸道和脂肪,從不同方向反復(fù)抽洗腹腔液,重復(fù)此步驟2次,將收集的腹腔液置于50ml的離心管;細(xì)胞懸液以1 200 r/min離心5min,用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);細(xì)胞懸液鋪入6孔培養(yǎng)板,37°C培養(yǎng)1h后用預(yù)熱培養(yǎng)基洗1次,留下貼壁細(xì)胞即為新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。以上細(xì)胞均在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中維持生長(zhǎng),置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.2 巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平檢測(cè) 采用Dot Blot法。將雙氫青蒿素稀釋到培養(yǎng)基中至終濃度分別為 20、40、60μmol/L,分別培養(yǎng)巨噬細(xì)胞 72h,設(shè)為觀察組;另采用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞72h,設(shè)為對(duì)照組。兩組巨噬細(xì)胞均用Trizol試劑提取總RNA,然后用多聚胸腺嘧啶(oligo-dT)磁珠純化獲得mRNA;將各組1μg mRNA滴加到PVDF膜上,紫外線交聯(lián)后用含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST緩沖液封閉2h,加入用封閉液稀釋后的m6A抗體4℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次;然后加入偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的兔二抗室溫孵育2h,TBST洗膜3次,最后用ECL法顯影。用ImageJ軟件對(duì)曝光圖片進(jìn)行灰度分析,將對(duì)照組的灰度定義為1,觀察組做相對(duì)應(yīng)的均一化處理,得出甲基化水平數(shù)據(jù)。

    1.2.3 巨噬細(xì)胞 METTL3、ALKBH5、FTO、TLR7、TLR9 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。兩組巨噬細(xì)胞總RNA的提取按Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行。用PBS洗2次細(xì)胞,按1×107個(gè)細(xì)胞加入1ml Trizol試劑抽提;加入0.2ml氯仿震蕩混勻,室溫靜置3 min后4℃14 000 r/min離心15min;吸取上層水相置于新管中,加入0.5ml異丙醇,充分混勻,室溫靜置10min后再離心30 min棄上清液,沉淀以75%乙醇溶液洗滌1次后空氣干燥;RNA溶解于40μl DEPC水中,用Nanodrop分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛公司)進(jìn)行濃度和純度測(cè)定后保存于-80℃。取 2μg細(xì)胞總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO公司)說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,于 42℃孵育30min,反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)99℃滅活5 min后加入80μl雙蒸水稀釋混勻,作PCR反應(yīng)的模板。采用SYBRGreen熒光定量PCR混合試劑(日本TOYOBO公司)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20μl):2×SYBR Premix Ex TaqTM(10μl),上游引物(10μmol/L,1.0μl),下游引物(10μmol/L,1.0μl),模板 cDNA(8.0μl)。反應(yīng)條件:95(3min);40 個(gè)循環(huán)(95℃,15s);60℃,40s(收集熒光)。mRNA 相對(duì)表達(dá)水平是以β-Actin做參照,即每次定量PCR的Ct值減去對(duì)應(yīng)樣品中β-Actin的Ct值,樣品擴(kuò)增的倍數(shù)變化計(jì)算采用2-ΔΔCt法。溶解曲線分析確認(rèn)定量PCR引物擴(kuò)增的特異性。引物序列如下:ALKBH5 F:5′-CGCGGTCATCAACGACTACC-3′,R:5′-ATGGGCTTGAACTGGAACTTG-3′;METTL3 F:5′-CTGGGCACTTGGATTTAAGGAA-3′,R:5′-TGAGAGGTGGTGTAGCAACTT-3′;FTO F:5′TTCATGCTGGATGACCTCAATG-3′,R:5′-GCCAACTGACAGCGTTCTAAG-3′;TLR7 F:5′-ATGTGGACACGGAAGAGACAA-3′,R:5′-GGTAAGGGTAAGATTGGTGGTG-3′;TLR9 F:5′-ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT-3′,R:5′-GAGGCTTCAGCTCACAGGG-3′;HPRT F:5′-TCAGTCAACGGGGGACATAAA-3′,R:5′-GGGGCTGTACTGCTTAACCAG-3′;β-Actin F:5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′,R:5′-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3′。

    1.2.4 巨噬細(xì)胞 METTL3、ALKBH5、FTO、TLR7、TLR9蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。將兩組巨噬細(xì)胞均用PBS洗1遍;在細(xì)胞裂解液中加入適量雞尾酒(cocktail)蛋白酶抑制劑和苯甲基硫酰氟(PMSF),混勻加入到待收的細(xì)胞中,冰上孵育5min后,刮下細(xì)胞并置于離心管中4℃震蕩,以最大轉(zhuǎn)速4℃離心15min,取上清液,采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,加入6×上樣緩沖液,100℃煮5 min,制備好的樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩H?0μg總蛋白進(jìn)行電泳分離,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含5%BSA的TBST封閉2h,加入用封閉液稀釋后的待測(cè)蛋白的抗體4℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,然后加入偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的相應(yīng)二抗室溫孵育2h,TBST洗膜3次,最后用ECL法顯影[6-7]。用ImageJ軟件對(duì)曝光后的灰度圖片進(jìn)行灰度分析,將對(duì)照組的灰度定義為1,觀察組做相對(duì)應(yīng)的均一化處理,得出蛋白表達(dá)水平數(shù)據(jù)。

    1.2.5 巨噬細(xì)胞TLR7和TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平檢測(cè) 采用m6A-qRT-PCR法。實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[8-9]。兩組巨噬細(xì)胞總RNA的提取按Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行??俁NA先用多聚Poly(A)選擇純化mRNA(FastTrack MAG micro mRNA分離試劑盒,美國(guó)Invitrogen公司),但mRNA不隨機(jī)打斷片段化,以便于用oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。然后按照m6A免疫共沉淀和測(cè)序的實(shí)驗(yàn)操作,但不構(gòu)建cDNA文庫(kù)。為比較m6A豐度的變化,相對(duì)富集首先做歸一化處理,然后再在m6A免疫沉淀的樣品數(shù)據(jù)之間進(jìn)行比較。

    1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較觀察組與對(duì)照組巨噬細(xì)胞(1)mRNA m6A 甲基化修飾水平;(2)METTL3、ALKBH5和 FTO mRNA 表達(dá)水平;(3)METTL3、ALKBH5 和 FTO蛋白表達(dá)水平;(4)TLR7和TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平;(5)TLR7和TLR9蛋白表達(dá)水平。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件,所有數(shù)據(jù)均由獨(dú)立的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到。計(jì)量資料以表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平比較 與對(duì)照組比較,觀察組巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平明顯降低(P<0.05),見圖1。

    圖1 兩組巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平比較Dot Blot圖

    2.2 兩組巨噬細(xì)胞 METTL3、ALKBH5、FTO mRNA表達(dá)水平比較 見表1。

    表1 兩組巨噬細(xì)胞METTL3、ALKBH5、FTOmRNA表達(dá)水平比較

    由表1可見,與對(duì)照組比較,雙氫青蒿素處理后觀察組巨噬細(xì)胞METTL3 mRNA表達(dá)下調(diào),而ALKBH5、Fto mRNA表達(dá)上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);且雙氫青蒿素處理濃度越高,METTL3 mRNA表達(dá)水平越低,ALKBH5 mRNA表達(dá)水平越高,而FTO mRNA表達(dá)水平對(duì)濃度不敏感。

    2.3 兩組巨噬細(xì)胞METTL3、ALKBH5、FTO蛋白表達(dá)水平比較 見圖2。

    圖2 兩組巨噬細(xì)胞METTL3、ALKBH5、FTO蛋白表達(dá)水平比較電泳圖

    由圖2可見,與對(duì)照組比較,雙氫青蒿素(40、60μmol/L)處理后觀察組巨噬細(xì)胞中METTL3蛋白表達(dá)下調(diào),而ALKBH5蛋白表達(dá)上調(diào),對(duì)FTO蛋白表達(dá)幾乎沒(méi)有影響;且雙氫青蒿素濃度越高,METTL3蛋白表達(dá)水平越低,ALKBH5蛋白表達(dá)水平越高。

    2.4 兩組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平比較 見表2。

    表2 兩組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平比較

    由表2可見,與對(duì)照組比較,用60μmol/L雙氫青蒿素處理后,觀察組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9 mRNA m6A甲基化修飾水平明顯下調(diào)。

    2.5 兩組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9蛋白表達(dá)水平比較見圖3。

    圖3 兩組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9蛋白表達(dá)水平比較電泳圖

    由圖3可見,與對(duì)照組比較,用60μmol/L雙氫青蒿素處理后,觀察組巨噬細(xì)胞TLR7、TLR9蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。

    3 討論

    SLE是一種發(fā)生于多器官、以病情反復(fù)為特征的自身免疫性疾病,其主要發(fā)病機(jī)制是機(jī)體的細(xì)胞凋亡異常以及B、T淋巴細(xì)胞活化閾值的改變,導(dǎo)致自我耐受能力下降和自身抗體的過(guò)量產(chǎn)生,隨后誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致多個(gè)組織器官的損傷[10]。METTL3是m6A甲基化過(guò)程中關(guān)鍵的甲基化酶,其酶活性和表達(dá)與m6A甲基化修飾水平呈正相關(guān),ALKBH5和FTO是重要的m6A去甲基化修飾蛋白[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在SLE小鼠的巨噬細(xì)胞中,60μmol/L的雙氫青蒿素能通過(guò)抑制METTL3的mRNA和蛋白的表達(dá),促進(jìn)ALKBH5和FTO的表達(dá),進(jìn)而從巨噬細(xì)胞整體水平上抑制mRNA m6A的甲基化修飾水平,但雙氫青蒿素如何調(diào)控METTL3、ALKBH5和FTO表達(dá)的機(jī)制需要進(jìn)一步的探討。

    屠呦呦團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素治療SLE的一期臨床療效顯著,且無(wú)明顯不良反應(yīng)。天然免疫系統(tǒng)在SLE的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用,特別是Toll樣受體,其異常表達(dá)或過(guò)度激活均可能導(dǎo)致SLE的發(fā)病[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),SLE患者的外周血中Ⅰ型干擾素濃度偏高[14-15]。雙氫青蒿素可能通過(guò)抑制TLR4/IRF/IFN信號(hào)通路,從而抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥因子和Ⅰ型干擾素的表達(dá),進(jìn)而對(duì)SLE小鼠發(fā)揮治療作用。青蒿素及其類似物的抗炎作用是通過(guò)抑制TLR受體和關(guān)鍵炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,包括核因子κB(NF-κB)、STAT1和增殖蛋白激酶(MAPK)等[14-15]。TLR7和TLR9這兩個(gè)核酸受體能感受細(xì)胞內(nèi)和外的核酸,進(jìn)而觸發(fā)下游的炎癥信號(hào)通路。本研究發(fā)現(xiàn)用60μmol/L雙氫青蒿素處理巨噬細(xì)胞后能明顯的降低TLR7和TLR9上的m6A甲基化修飾水平,進(jìn)而抑制TLR7和TLR9蛋白的表達(dá),從而緩解巨噬細(xì)胞TLR7和TLR9表達(dá)異常所觸發(fā)的炎癥,減緩SLE的癥狀。本研究主要是在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了雙氫青蒿素對(duì)SLE小鼠的治療作用,在小鼠體內(nèi)探討雙氫青蒿素生物學(xué)作用將是接下來(lái)的研究方向。

    綜上所述,雙氫青蒿素可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平抑制TLR7和TLR9蛋白表達(dá)的機(jī)制發(fā)揮治療SLE的作用。

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